Identification and evaluation of biocontrol agents of citrus replant pathogens
Date
2021-12
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Citrus is the second largest fruit crop in South Africa with a well-known position in the fruit
industry due to its local consumption and exports to neighbouring countries. Citrus is susceptible
to several pathogens that cause incalculable losses to the crop. One of these afflictions is
replant disease which is associated with a complex of soilborne pathogens. Replant disease is
observed where young, healthy nursery trees are planted on old orchard sites. The phenomenon is
characterised by the newly planted trees being stunted with small leaves and showing low vigour.
The major soilborne pathogens associated with replant soils are Phytophthora nicotianae,
Phytophthora citrophthora, Pythium irregulare s.s. and Neocosmospora species. At present, no
biological control measures are available to manage the complex of replant pathogens, as previous
studies conducted in South Africa have only focused on the effect of different biocontrol agents
(BCAs) on Phytophthora spp. related to citrus and did not consider other oomycete pathogens such as
Pythium spp., fungal pathogens such as Neocosmospora spp., or instances where these pathogens occur
together. Therefore, the aim of this study was to identify and evaluate potential biocontrol agents
obtained from old citrus soils for the management of the citrus replant pathogen complex.
Rhizospheric soil along with their roots were collected from two orchards, Citrusdal (Western Cape)
and Kirkwood (Eastern Cape) that showed replant problems. Soil samples were subjected to serial
dilution plating using mediums, NA, PDA and PDA+, while roots were also plated out on these
mentioned mediums. The isolation of microorganisms from soil and roots was focused on Bacillus,
Pseudomonas and Trichoderma spp., as these are known to have potential as BCAs. For the preliminary
selection of potential candidates from all isolates found in the citrus orchards, a non-volatile
test was performed for Trichoderma spp. and for the bacterial isolates, the dual culture test was
used. From the eight Trichoderma isolates and 48 bacterial isolates obtained from the citrus
rhizosphere soil and roots, two Trichoderma isolates and two bacterial isolates were selected and
were molecularly identified as Trichoderma harzianum, Bacillus subtilis and Pseudomonas
fluorescens. These selected candidates inhibited the growth of the pathogen complex by at least 50%
compared to the control and it was assumed that it is satisfactory to possibly be a BCA. The
selected BCAs were consequently subjected to further in vitro screening, where T. harzianum
isolates, P4 and P16 were subjected to a volatile and dual culture test, while B. subtilis N19 and
P. fluorescens N83 were subjected to a non-volatile and volatile test. Generally, the results of
the non-volatile tests were satisfactory, as it showed that Trichoderma, Bacillus and
Pseudomonas spp. has different inhibitory abilities against the replant pathogens and was therefore
the best screening test.
It has been shown that the T. harzianum isolates can be used against the whole complex of replant
pathogens, while the bacterial isolates showed only good antagonistic activity against the oomycete
pathogens. Based on this observation we hypothesize that the mode-of-action for the selected BCAs
could be due to antibiosis (non-volatile test). The efficacy of the selected BCAs to colonize the
roots of Troyer citrange seedlings and promote plant growth was also investigated. This was done by
determining the effect of the interaction between seedlings treated with the pathogen alone,
biocontrol alone and pathogen with biocontrol combination, by using specific growth parameters
along with re-isolation of the pathogen and BCA. High levels of the pathogen were observed in the
seedlings treated with the pathogen only. The BCAs were also able to colonize the roots at high
levels. However, it was also clear that the BCA or pathogen population did not decrease when
combined. Two exceptions were found, where P. fluorescens N83 had a higher colonization level when
challenged with P. nicotianae, and T harzianum P16 colonization levels were lower in the presence
of P. irregulare s.s. Regarding the growth parameters, it was found that none of the treatments had
any significant effect on the plant growth. The relatively poor response of the plants to the BCAs
may be because the BCAs may have needed more time to establish a symbiotic relationship with the
plant before it could have any benefits. Therefore, it would be advisable to further investigate
where optimal conditions can be established to obtain a clearer picture of the influence of the
BCA on the replant pathogens.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Sitrus is die tweede grootste vrugte-oes in Suid-Afrika met 'n bekende posisie in die vrugtebedryf as gevolg van die plaaslike verbruik en uitvoer na buurlande. Sitrus is vatbaar vir verskeie patogene wat onberekenbare verliese vir die gewas veroorsaak. Een so ‘n geval is herplant siekte wat veroorsaak word deur 'n kompleks van grondgedraagde patogene. Herplant siekte is 'n verskynsel wat waargeneem word in gevalle waar jong, gesonde boompies op ou persele herplant word. Die verskynsel word gekenmerk deur nuut geplante bome met klein blaartjies en swak groei. Die belangrikste grond patogene wat verband hou met herplant siekte is Phytophthora nicotianae, Phytophthora citrophthora, Pythium irregulare s.s. en Neocosmospora spesies. Huidiglik is daar geen biologiese beheermaatreëls beskikbaar om die kompleks van herplant patogene te bestuur nie, aangesien vorige studies in Suid -Afrika slegs gefokus het op die effek van verskillende biobeheermiddels op Phytophthora spp. wat van belang is op sitrus is en het nie biobeheer van ander patogene soos Pythium spp. of Neocosmospora spp. getoets nie. Die doel van hierdie studie was dus om potensiële biobeheermiddels vanuit ou sitrusgronde te verkry, te identifiseer en te evalueer vir die bestuur van die sitrus herplantpatogeen kompleks. Risosferiese grond saam met hul wortels is versamel uit twee boorde, Citrusdal (Wes- Kaap) en Kirkwood (Oos-Kaap) wat herplant simptome getoon het. Grondmonsters is onderwerp aan reeksverdunnings en mediums, NA, PDA en PDA+ was gebruik, terwyl wortels ook op hierdie genoemde mediums uitgeplaat is. Die isolasie van moontlike biobeheermiddels was gefokus op Bacillus, Pseudomonas en Trichoderma spp. aangesien dit bekend is as potensiële biobeheermiddels. Vir die voorlopige keuse van potensiële kandidate wat gevind is in die sitrusboorde, is 'n nie-vlugtige toets vir Trichoderma spp uitgevoer en vir die bakteriese isolate is die dubbelkultuur-toets gebruik. Vanuit die agt Trichoderma isolate en 48 bakteriële isolate wat verkry was vanuit die sitrus-risosfeergrond en boomwortels, is twee Trichoderma isolate en twee bakteriese isolate gekies wat molekulêr geïdentifiseer is as Trichoderma harzianum, Bacillus subtilis en Pseudomonas fluorescens. Hierdie geselekteerde kandidate het die groei van die patogeenkompleks met minstens 50% inhibeer in vergelyking met die kontrole en daar is aanvaar dat dit bevredigend is om moontlik 'n BCA te wees. Hierdie geselekteerde biobeheermiddels is gevolglik onderwerp aan verdere in vitro- sifting, waar T. harzianum-isolate P4 en P16 aan 'n vlugtige en dubbele kultuurtoets onderwerp is, terwyl B. subtilis N19 en P. fluorescens N83 onderwerp is aan 'n nie-vlugtige en vlugtige toets. Oor die algemeen was die resultate van die nie-vlugtige toetse bevredigend, aangesien dit getoon het dat Trichoderma, Bacillus en Pseudomonas spp. het verskillende inhiberende vermoëns teen die herplant patogene en was dus die beste siftingstoets. Daar is aangetoon dat die T. harzianum isolate teen die hele kompleks van herplant patogene gebruik kan word, terwyl die bakteriese isolate slegs goeie antagonistiese aktiwiteit teen die oomiseet patogene getoon het. Op grond van hierdie waarneming hipotiseer ons dat die werkingswyse vir die geselekteerde BCAs as gevolg van aan antibiose (nie-vlugtige toets). Daarbewens het ons ook die doeltreffendheid van T. harzianum isolate, B. subtilis N19 en P. fluorescens N83 om die wortels van Troyer citrange saailinge te koloniseer en plantgroei te bevorder, geëvalueer. Interaksies tussen die patogeen kontrole, biobeheer kontrole en patogeen met biokontrole kombinasie is bepaal, deur gebruik te maak van spesifieke groeiparameters tesame met her-isolasie van die patogeen en BCA. Hoë vlakke van die patogeen is waargeneem in die saailinge wat slegs met die patogeen behandel is. Die biobeheermidels kon ook die wortels teen hoë vlakkekoloniseer. Dit was egter ook duidelik dat die BCA of patogeen populasie nie afgeneem het wanneer dit in kombinasie was.Twee uitsonderings is gevind, waar P. fluorescens N83 hoër kolonisasievlakke gehad het toe dit met P. nicotianae uitgedaag is, en dat T harzianum P16 kolonisasievlakke laer was in die teenwoordigheid van P. irregulare s.s. Wat die groeiparameters betref, is daar gevind dat geen van die behandelings ‘n uitwerking op die plantegroei het nie. Die relatiewe swak reaksie van die plante met die biobeheermiddels kan wees omdat die biobeheermiddels meer tyd nodig gehad het om 'n simbiotiese verhouding met die plant te vestig voordat dit voordele kon inhou. Daarom is dit raadsaam om verder te ondersoek in te stel, waar optimale toestande vasgestel kan word om 'n duideliker beeld te kry van die invloed van die biobeheermidels op die herplant patogene.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Sitrus is die tweede grootste vrugte-oes in Suid-Afrika met 'n bekende posisie in die vrugtebedryf as gevolg van die plaaslike verbruik en uitvoer na buurlande. Sitrus is vatbaar vir verskeie patogene wat onberekenbare verliese vir die gewas veroorsaak. Een so ‘n geval is herplant siekte wat veroorsaak word deur 'n kompleks van grondgedraagde patogene. Herplant siekte is 'n verskynsel wat waargeneem word in gevalle waar jong, gesonde boompies op ou persele herplant word. Die verskynsel word gekenmerk deur nuut geplante bome met klein blaartjies en swak groei. Die belangrikste grond patogene wat verband hou met herplant siekte is Phytophthora nicotianae, Phytophthora citrophthora, Pythium irregulare s.s. en Neocosmospora spesies. Huidiglik is daar geen biologiese beheermaatreëls beskikbaar om die kompleks van herplant patogene te bestuur nie, aangesien vorige studies in Suid -Afrika slegs gefokus het op die effek van verskillende biobeheermiddels op Phytophthora spp. wat van belang is op sitrus is en het nie biobeheer van ander patogene soos Pythium spp. of Neocosmospora spp. getoets nie. Die doel van hierdie studie was dus om potensiële biobeheermiddels vanuit ou sitrusgronde te verkry, te identifiseer en te evalueer vir die bestuur van die sitrus herplantpatogeen kompleks. Risosferiese grond saam met hul wortels is versamel uit twee boorde, Citrusdal (Wes- Kaap) en Kirkwood (Oos-Kaap) wat herplant simptome getoon het. Grondmonsters is onderwerp aan reeksverdunnings en mediums, NA, PDA en PDA+ was gebruik, terwyl wortels ook op hierdie genoemde mediums uitgeplaat is. Die isolasie van moontlike biobeheermiddels was gefokus op Bacillus, Pseudomonas en Trichoderma spp. aangesien dit bekend is as potensiële biobeheermiddels. Vir die voorlopige keuse van potensiële kandidate wat gevind is in die sitrusboorde, is 'n nie-vlugtige toets vir Trichoderma spp uitgevoer en vir die bakteriese isolate is die dubbelkultuur-toets gebruik. Vanuit die agt Trichoderma isolate en 48 bakteriële isolate wat verkry was vanuit die sitrus-risosfeergrond en boomwortels, is twee Trichoderma isolate en twee bakteriese isolate gekies wat molekulêr geïdentifiseer is as Trichoderma harzianum, Bacillus subtilis en Pseudomonas fluorescens. Hierdie geselekteerde kandidate het die groei van die patogeenkompleks met minstens 50% inhibeer in vergelyking met die kontrole en daar is aanvaar dat dit bevredigend is om moontlik 'n BCA te wees. Hierdie geselekteerde biobeheermiddels is gevolglik onderwerp aan verdere in vitro- sifting, waar T. harzianum-isolate P4 en P16 aan 'n vlugtige en dubbele kultuurtoets onderwerp is, terwyl B. subtilis N19 en P. fluorescens N83 onderwerp is aan 'n nie-vlugtige en vlugtige toets. Oor die algemeen was die resultate van die nie-vlugtige toetse bevredigend, aangesien dit getoon het dat Trichoderma, Bacillus en Pseudomonas spp. het verskillende inhiberende vermoëns teen die herplant patogene en was dus die beste siftingstoets. Daar is aangetoon dat die T. harzianum isolate teen die hele kompleks van herplant patogene gebruik kan word, terwyl die bakteriese isolate slegs goeie antagonistiese aktiwiteit teen die oomiseet patogene getoon het. Op grond van hierdie waarneming hipotiseer ons dat die werkingswyse vir die geselekteerde BCAs as gevolg van aan antibiose (nie-vlugtige toets). Daarbewens het ons ook die doeltreffendheid van T. harzianum isolate, B. subtilis N19 en P. fluorescens N83 om die wortels van Troyer citrange saailinge te koloniseer en plantgroei te bevorder, geëvalueer. Interaksies tussen die patogeen kontrole, biobeheer kontrole en patogeen met biokontrole kombinasie is bepaal, deur gebruik te maak van spesifieke groeiparameters tesame met her-isolasie van die patogeen en BCA. Hoë vlakke van die patogeen is waargeneem in die saailinge wat slegs met die patogeen behandel is. Die biobeheermidels kon ook die wortels teen hoë vlakkekoloniseer. Dit was egter ook duidelik dat die BCA of patogeen populasie nie afgeneem het wanneer dit in kombinasie was.Twee uitsonderings is gevind, waar P. fluorescens N83 hoër kolonisasievlakke gehad het toe dit met P. nicotianae uitgedaag is, en dat T harzianum P16 kolonisasievlakke laer was in die teenwoordigheid van P. irregulare s.s. Wat die groeiparameters betref, is daar gevind dat geen van die behandelings ‘n uitwerking op die plantegroei het nie. Die relatiewe swak reaksie van die plante met die biobeheermiddels kan wees omdat die biobeheermiddels meer tyd nodig gehad het om 'n simbiotiese verhouding met die plant te vestig voordat dit voordele kon inhou. Daarom is dit raadsaam om verder te ondersoek in te stel, waar optimale toestande vasgestel kan word om 'n duideliker beeld te kry van die invloed van die biobeheermidels op die herplant patogene.
Description
Thesis (MScAgric)--Stellenbosch University, 2021.