Diversity and Ecology of Astroviruses in South African Bats
Date
2020-03
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Emerging infectious diseases are mostly zoonotic in origin and defined as “infections that have newly emerged
in a population or have existed but are rapidly increasing in incidence or geographic range". Zoonotic viruses
are directly (e.g. bite from a rabid bat) or indirectly (via an intermediate host or vector) transmitted from
animals to humans. Bats have received increasing attention as potential hostsfor zoonotic diseases. Bats belong
to the order Chiroptera, which consists of two suborders: Yinpterochiroptera and Yangochiroptera. More than
1 300 species have been described globally, occurring on almost all continents excluding Antarctica. Specific
physiological and ecological characteristics make bats extraordinary evolutionary vessels to carry numerous
infectious agents including pathogens.
Astroviruses (AstVs) are amongst the vast array of viruses that have been detected in bats. AstVs are single
stranded, positive sense, RNA viruses that are transmitted via the faecal-oral route. Infection with AstVs causes
acute diarrhoea, however, more serious clinical presentations such as neurological deficits, stunted growth and
encephalitis have also been documented. Bats on the other hand, seem to be asymptomatically infected with
AstVs. Little attention has been given to the evolution, phylogenetic relationship, ecology and diversity of
AstVs in South African bats. In 2013 the first study in South Africa screening for a variety of viruses in small mammals, including SAn bats, found that bats were frequently co-infected with AstVs and coronaviruses.
The overall aims of the current study were to describe the prevalence, diversity and ecology of AstVs in South
African bats, to determine the potential threat to environmental and animal health at wastewater treatment
works (WWTW) through testing water and bat samples for the presence of AstVs, to monitor AstV and CoV
co-infection in a Neoromicia capensis colony over time and to isolate and propagate a bat AstV in vitro. The
results will be used to determine the potential One Health implications of AstVs in a South African setting.
Sample collection was done via non-invasive capture and release methods by collaborating zoologists.
Morphological and ecological data of each bat were recorded. Bat faecal samples (n=500) were screened for
AstVs using the hemi-nested screening assay that targets the RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) gene
of the virus. Plasmid positive controls were generated to ensure an optimal AstV screening PCR assay.
The One Health concept emphasizes the interlinkage between human, animal and environmental health. To
determine the impact that potential exposure to human AstVs at WWTW might have on animal and
environmental health, water samples upstream and downstream of two WWTW were also collected and
screened for AstVs.
The overall detection rate of AstVs across bat species was 13%, but it differed significantly between species
(Miniopterus natalensis, 55%; Rhinolophus capensis, 39%; and R. clivosus, 17%). Positive samples were
further analysed to try and amplify the capsid protein gene (ORF2), which is highly variable and only one
ORF2 gene fragment was obtained.
Twenty-five novel AstV RdRp sequences and one ORF2 sequence were identified, bringing the total RdRp
sequences available for South African bat AstVs to forty-four. Maximum likelihood analyses of the RdRp gene
fragments suggest that South African bat AstVs are not restricted by host species identity or geographical
location. Interestingly, the maximum likelihood analyses of the ORF2 sequence suggest that the South African
bat AstVs might be more similar to human AstVs from Japan compared to any bat AstVs.
The water samples collected from the WWTW tested negative for the presence of AstVs and only one bat
sample collected at the WWTW tested positive for AstV.
Two real-time PCR assays were designed to monitor AstVs and coronaviruses in a N. capensis colony over
time, as these two viruses regularly co-infect bats. The results indicated that both these viruses had a single
amplification peak that was associated with colony formation after migration. Interestingly the peak in viral
loads did not correlate with the pupping season of the bats, as was found by another study conducted on these
two viruses in Germany.
Statistical analyses of ecological and individual bat factors suggest that being a sexually active adult male bat,
species identity and occurrence in the Succulent Karoo biome could contribute to AstV positivity.
The current study was the first ever to successfully isolate and propagate a Miniopterus bat derived AstV in
vitro. During the isolation attempts three different cell lines were used, human adenocarcinoma, Neoromicia
capensis kidney and baby hamster kidney cells. Isolation and propagation was only successful in the baby
hamster kidney cells. The refined protocol for isolation and propagation of bat AstVs in cell culture will enable
future studies to successfully isolate bat AstVs as well as enable genomic and functional studies. The results
also gave insight into the potential zoonotic risk of bat AstVs.
The findings of the current study indicated that bat AstVs are diverse and relatively prevalent in South African
bats. Phylogenetic analyses of the 24 novel RdRp and one ORF2 genes from this study indicated that the virus
was not limited by species identity or host geographical range. Furthermore, the phylogenetic analyses of the
bat AstV ORF2 gene would suggest that the bat AstV is more similar to human AstVs, which could imply that
South African bat AstVs have zoonotic potential. The results of current study gave some potential insights into
the One Health implications of AstVs in the SA setting.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Opkomende aansteeklike siektes word gedefinieer as “infeksies wat onlangs verskyn het in ʼn populasie of wat al lank reeds teenwoordig was in ʼn populasie maar vinnig toeneem in insidensie of geografiese verspreiding”. Die meerderheid van opkomende aansteeklike siektes is zoonoties in oorsprong, wat beteken dat hul oorspronklik in diere voorgekom het, maar nou na mense oorgedra kan word. Zoonotiese virusse kan direk oorgedra word na die mens bv. deur gebyt te raak deur ʼn hond met hondsdolheid of indirek deur ʼn tussenganger gasheer of vektor. Met die soeke na wilde diere wat dien as gashere van moontlike zoonotiese siektes was vlermuise geïdentifiseer as belangrike gashere vir verskeie potensiële zoonotiese siektes. Vlermuise behoort aan die orde Chiroptera wat verder in twee subordes verdeel word, naamlik Yinpterochiroptera en Yangochiroptera. Die orde Chiroptera is baie divers met meer as 1300 spesies wat globaal beskryf is en voorkom op alle vastelande, uitsluitend Antarktika. Daar is verskeie eienskappe (fisiologies en ekologies) wat vlermuise besonderse evolusionêre vaartuie maak om as draers te dien vir verskeie patogene. Astrovirusse (AstVs) is een groep van verskeie virusse wat in vlermuise voorkom. AstVs is enkelstring, positiewe sense, RNA virusse wat via die fekale-orale roete versprei word. Infeksie met AstVs veroorsaak gewoonlik akute diarree, maar meer ernstige simptome soos neurologiese afwykings, vertraagde groei asook enkefalitis is al waargeneem. Dit wil voorkom of vlermuise asimptomaties geïnfekteer word deur die virus. Baie min aandag is geskenk aan die evolusie, filogenetiese verwantskappe, ekologie en diversiteit van AstVs wat in Suid Afrikaanse (SA) vlermuise voorkom. Die enigste bestaande studie wat AstVs bestudeer het in SA vlermuise was uitgevoer deur Dr Ithete tydens haar doktorale studie. Die studie deur Ithete (2013) was hoofsaaklik ʼn verkenning studie om te bepaal watter virusse in klein soogdiere voorkom in SA, daar was egter nie ʼn in-diepte ondersoek na die diversiteit en ekologie van AstVs nie. Tydens die huidige studie was die diversiteit en ekologie van AstVs in SA vlermuise bestudeer deur gebruik te maak van molekulêre-, filogenetiese- en statistiese metodes. Vlermuis monsters wat gebruik is tydens die huidige studie, was verskaf deur samewerkende dierkundiges met etiese toestemming. Die meerderheid van die monsters was versamel deur nie-indringende metodes, wat vang en vrylating van die vlermuise vereis het. Tydens die versameling van vlermuise morfologiese data was gedokumenteer asook ekologiese data. ʼn Totaal van vyfhonderd mis monsters was getoets vir die teenwoordigheid van AstVs deur gebruik te maak van ʼn polimerase ketting reaksie (PKR). Die PCR toets teiken die RNA-afhanklike RNA polimerase (RdRp) geen van die virus. Om te verseker dat die PKR toets wat reg toegepas word, was ʼn plasmied positiewe kontrole geproduseer. Die plasmied positiewe kontrole was in vitro getranskribeer na RNA om te verseker dat al die stappe, vanaf omgekeerde transkripsie van onttrekte RNA, gevolg deur die AstV PKR toets, reg verloop. Die virus was opgespoor in 13% van al die monsters wat getoets was vir AstVs. Die opsporing het wel verskil tussen vlermuis spesies, met die hoogste voorkoms van die virus in Miniopterus natalensis (55%) gevolg deur Rhinolophus capensis (39%) en Rhinolophus clivosus (17%). Monsters wat positief getoets het vir AstV is verder geanaliseer om ʼn groter fragment van die virus te probeer bekom, naamlik die kapsied proteïen voorloper geen (ORF2). ʼn PKR toets wat ontwikkel is deur Atkins et al., (2009) was gebruik. Aangesien die kapsied proteïen geen baie divers is, het meeste pogings misluk en slegs een ORF2 geen fragment is bekom. ʼn Totaal van 25 nuwe AstV RdRp gene asook een ORF2 geen is geïdentifiseer. Dit bring die totaal van AstVs RdRp geen volgordes wat beskikbaar is vir AstVs van SA vlermuise na 44. Die filogenetiese analise van die RdRp gene het gedui dat daar geen definitiewe patroon is in terme van groeperings nie, dit wil voorkom of SA vlermuis AstV nie beperk word deur gasheer spesie of geografiese verspreiding nie. Interessant genoeg het die maksimum waarskynlikheidsanalise van die ORF2 geen aangedui dat die SA vlermuis AstVs meer soortgelyk is aan mens AstVs as aan vlermuis AstVs. Tydens die studie was daar gebruik gemaak van twee real-time qPCR (werklike tyd kwantitatiewe polimerase ketting reaksie) toetse om AstVs asook caronavirusse te monitor in ʼn Neoromicia capensis vlermuis kolonie. Die resultate het getoon dat albei virusse een amplifikasie hoogtepunt bereik het na kolonie formasie na migrasie. Die piek in virus lading was nie geassosieer met die geboorte van nuwelinge nie, soos wat voorheen deur ander studies bevind was nie. Statistiese analises van ekologiese- en individuele vlermuis metings het getoon dat die volgende faktore moontlik kan bydra tot AstV positiwiteit in vlermuise: geslag (seksueel aktiewe mannetjies), spesies identiteit asook bioom (Sukkulente Karoo). Die huidige studie was die eerste ter wêreld om ʼn vlermuis AstV suksesvol te isoleer en propageer in vitro. Tydens die isolasie pogings was drie verskillende sellyne gebruik: menslike adenokarsinoom (Caco-2), Neoromicia capensis nier selle (NCK) asook hamster nier selle (BHK G43). Die isolasie was slegs suksesvol in die hamster nier selle. Daar is verskeie faktore wat ʼn bydra kon lewer tot die sukses van die isolasie poging naamlik die monster tipe wat gebruik was as inokulum, die media komposisie, sellyn tipe asook die inkubasie tydperk na die sellyn geïnokuleer is. Die suksesvolle isolasie van ʼn vlermuis AstV in vitro sal opkomende studies in staat stel om ook suksesvolle isolasies te doen asook verdere genetiese toetse bv. volledige genoom toetse. Die bevindinge van die huidige studie toon dat SA vlermuis AstVs relatief volop is en dat hul ook divers is. Vyf-en-twinting RdRp geen volgordes en een ORF2 geen volgorde is bekom in die studie. Filogenetiese analises van die RdRp geen volgordes het getoon dat die virus nie deur gasheer spesie of geografiese verspreiding beperk word nie. Interessant genoeg het die filogenetiese analise van die ORF2 geen volgorde getoon dat die SA vlermuis AstV nader verwant is aan menslike AstVs as aan vlermuis AstVs, wat moontlike zoonotiese potensiaal impliseer. Die suksesvolle isolasie van ʼn vlermuis AstV in vitro is ʼn groot bydra tot toekomstige studies wat die genoom asook funksionele biologie van die virus verder wil bestudeer.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Opkomende aansteeklike siektes word gedefinieer as “infeksies wat onlangs verskyn het in ʼn populasie of wat al lank reeds teenwoordig was in ʼn populasie maar vinnig toeneem in insidensie of geografiese verspreiding”. Die meerderheid van opkomende aansteeklike siektes is zoonoties in oorsprong, wat beteken dat hul oorspronklik in diere voorgekom het, maar nou na mense oorgedra kan word. Zoonotiese virusse kan direk oorgedra word na die mens bv. deur gebyt te raak deur ʼn hond met hondsdolheid of indirek deur ʼn tussenganger gasheer of vektor. Met die soeke na wilde diere wat dien as gashere van moontlike zoonotiese siektes was vlermuise geïdentifiseer as belangrike gashere vir verskeie potensiële zoonotiese siektes. Vlermuise behoort aan die orde Chiroptera wat verder in twee subordes verdeel word, naamlik Yinpterochiroptera en Yangochiroptera. Die orde Chiroptera is baie divers met meer as 1300 spesies wat globaal beskryf is en voorkom op alle vastelande, uitsluitend Antarktika. Daar is verskeie eienskappe (fisiologies en ekologies) wat vlermuise besonderse evolusionêre vaartuie maak om as draers te dien vir verskeie patogene. Astrovirusse (AstVs) is een groep van verskeie virusse wat in vlermuise voorkom. AstVs is enkelstring, positiewe sense, RNA virusse wat via die fekale-orale roete versprei word. Infeksie met AstVs veroorsaak gewoonlik akute diarree, maar meer ernstige simptome soos neurologiese afwykings, vertraagde groei asook enkefalitis is al waargeneem. Dit wil voorkom of vlermuise asimptomaties geïnfekteer word deur die virus. Baie min aandag is geskenk aan die evolusie, filogenetiese verwantskappe, ekologie en diversiteit van AstVs wat in Suid Afrikaanse (SA) vlermuise voorkom. Die enigste bestaande studie wat AstVs bestudeer het in SA vlermuise was uitgevoer deur Dr Ithete tydens haar doktorale studie. Die studie deur Ithete (2013) was hoofsaaklik ʼn verkenning studie om te bepaal watter virusse in klein soogdiere voorkom in SA, daar was egter nie ʼn in-diepte ondersoek na die diversiteit en ekologie van AstVs nie. Tydens die huidige studie was die diversiteit en ekologie van AstVs in SA vlermuise bestudeer deur gebruik te maak van molekulêre-, filogenetiese- en statistiese metodes. Vlermuis monsters wat gebruik is tydens die huidige studie, was verskaf deur samewerkende dierkundiges met etiese toestemming. Die meerderheid van die monsters was versamel deur nie-indringende metodes, wat vang en vrylating van die vlermuise vereis het. Tydens die versameling van vlermuise morfologiese data was gedokumenteer asook ekologiese data. ʼn Totaal van vyfhonderd mis monsters was getoets vir die teenwoordigheid van AstVs deur gebruik te maak van ʼn polimerase ketting reaksie (PKR). Die PCR toets teiken die RNA-afhanklike RNA polimerase (RdRp) geen van die virus. Om te verseker dat die PKR toets wat reg toegepas word, was ʼn plasmied positiewe kontrole geproduseer. Die plasmied positiewe kontrole was in vitro getranskribeer na RNA om te verseker dat al die stappe, vanaf omgekeerde transkripsie van onttrekte RNA, gevolg deur die AstV PKR toets, reg verloop. Die virus was opgespoor in 13% van al die monsters wat getoets was vir AstVs. Die opsporing het wel verskil tussen vlermuis spesies, met die hoogste voorkoms van die virus in Miniopterus natalensis (55%) gevolg deur Rhinolophus capensis (39%) en Rhinolophus clivosus (17%). Monsters wat positief getoets het vir AstV is verder geanaliseer om ʼn groter fragment van die virus te probeer bekom, naamlik die kapsied proteïen voorloper geen (ORF2). ʼn PKR toets wat ontwikkel is deur Atkins et al., (2009) was gebruik. Aangesien die kapsied proteïen geen baie divers is, het meeste pogings misluk en slegs een ORF2 geen fragment is bekom. ʼn Totaal van 25 nuwe AstV RdRp gene asook een ORF2 geen is geïdentifiseer. Dit bring die totaal van AstVs RdRp geen volgordes wat beskikbaar is vir AstVs van SA vlermuise na 44. Die filogenetiese analise van die RdRp gene het gedui dat daar geen definitiewe patroon is in terme van groeperings nie, dit wil voorkom of SA vlermuis AstV nie beperk word deur gasheer spesie of geografiese verspreiding nie. Interessant genoeg het die maksimum waarskynlikheidsanalise van die ORF2 geen aangedui dat die SA vlermuis AstVs meer soortgelyk is aan mens AstVs as aan vlermuis AstVs. Tydens die studie was daar gebruik gemaak van twee real-time qPCR (werklike tyd kwantitatiewe polimerase ketting reaksie) toetse om AstVs asook caronavirusse te monitor in ʼn Neoromicia capensis vlermuis kolonie. Die resultate het getoon dat albei virusse een amplifikasie hoogtepunt bereik het na kolonie formasie na migrasie. Die piek in virus lading was nie geassosieer met die geboorte van nuwelinge nie, soos wat voorheen deur ander studies bevind was nie. Statistiese analises van ekologiese- en individuele vlermuis metings het getoon dat die volgende faktore moontlik kan bydra tot AstV positiwiteit in vlermuise: geslag (seksueel aktiewe mannetjies), spesies identiteit asook bioom (Sukkulente Karoo). Die huidige studie was die eerste ter wêreld om ʼn vlermuis AstV suksesvol te isoleer en propageer in vitro. Tydens die isolasie pogings was drie verskillende sellyne gebruik: menslike adenokarsinoom (Caco-2), Neoromicia capensis nier selle (NCK) asook hamster nier selle (BHK G43). Die isolasie was slegs suksesvol in die hamster nier selle. Daar is verskeie faktore wat ʼn bydra kon lewer tot die sukses van die isolasie poging naamlik die monster tipe wat gebruik was as inokulum, die media komposisie, sellyn tipe asook die inkubasie tydperk na die sellyn geïnokuleer is. Die suksesvolle isolasie van ʼn vlermuis AstV in vitro sal opkomende studies in staat stel om ook suksesvolle isolasies te doen asook verdere genetiese toetse bv. volledige genoom toetse. Die bevindinge van die huidige studie toon dat SA vlermuis AstVs relatief volop is en dat hul ook divers is. Vyf-en-twinting RdRp geen volgordes en een ORF2 geen volgorde is bekom in die studie. Filogenetiese analises van die RdRp geen volgordes het getoon dat die virus nie deur gasheer spesie of geografiese verspreiding beperk word nie. Interessant genoeg het die filogenetiese analise van die ORF2 geen volgorde getoon dat die SA vlermuis AstV nader verwant is aan menslike AstVs as aan vlermuis AstVs, wat moontlike zoonotiese potensiaal impliseer. Die suksesvolle isolasie van ʼn vlermuis AstV in vitro is ʼn groot bydra tot toekomstige studies wat die genoom asook funksionele biologie van die virus verder wil bestudeer.
Description
Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2020.
Keywords
Zoonotic diseases, Virology, Infectious diseases, Bats -- Viruses, Astroviruses