Construction and evaluation of citrus tristeza virus-based gene silencing vectors that target Trioza erytreae and Diaphorina citri
Date
2022-04
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Citrus greening is an incurable and devastating bacterial disease caused by species of phloem-
limited Candidatus Liberibacters, transmitted by two phloem-sap feeding insects, Diaphorina citri
and Trioza erytreae. Citrus greening poses a constant threat to the success and stability of
citriculture worldwide. The pathogen-insect combination of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas)
and D. citri, responsible for the most severe form of citrus greening, Huanglongbing (HLB), was
reported in Northern Africa for the first time in 2010 and 2016 respectively. Confirmation that the
endemic insect vector of Candidatus Liberibacter africanus (CLaf), T. erytreae, can also transmit
CLas has significantly increased the risk of HLB reaching South Africa. Until a cure is discovered,
the development of a reliable insect vector control strategy is critical. This study aimed to convert an
infectious clone of citrus tristeza virus (CTVfl6) into a virus-induced gene silencing (VIGS) vector that
targets critical genes in the citrus greening insect vectors and bioinformatically profile the virus-
induced small interfering RNAs (vsiRNAs) produced in planta. This putative control strategy is
uniquely specific due to the sequence specificity of the RNAi machinery and the phloem-limited
infection of CTV. Four candidate genes, arginine kinase, abnormal wing disc, chitin synthase and
ran GTPase, were selected as RNAi targets, and six insect- and gene-specific silencing inserts were
constructed. A set of 24 intermediate plasmids was assembled, harbouring the silencing inserts in
the 3’ terminal end of CTVfl6. These intermediates differed by silencing insert orientation and
presence or absence of an upstream duplicated CTV coat protein controller element to evaluate the
influence of CTV VIGS vector configuration on vsiRNA production in planta. Assembly of the
complete CTVfl6 VIGS vectors was attempted by replacing the 3’ end of the original sequence with
the newly engineered intermediate 3’ end. Only three of the 24 were successfully assembled, two T.
erytreae insect-specific and one abnormal wing disc gene-specific. Systemic CTV VIGS vector
infection was observed in 22% to 33% of N. benthamiana plants 5-6 weeks post-Agrobacterium
tumefaciens-infiltration, indicating that CTVfl6 can tolerate large exogenous insertions in the 3’
terminal end. Inoculation into Mexican lime was attempted for the T. erytreae specific CTV VIGS
vectors. As CTV was not yet detectable in Mexican lime at the time of sampling, small RNA (sRNA)
sequencing was only conducted on CTV positive N. benthamiana material. The vsiRNA coverage
across the CTV VIGS vector genomes was over >99%. Hotspots in vsiRNA alignment depth were
observed at two of CTV’s silencing suppressors, providing detail on host plant-virus interaction.
Insert-specific vsiRNAs were produced in planta, covering >99.78% of the silencing insert. The
production of insect-specific vsiRNAs provides some proof of concept for this vsiRNA delivery
strategy. The influence of RNAi-mediated knockdown on insect development and mortality should
be tested using greenhouse trials. This study has generated the first putative RNAi-based control
strategy for the endemic South African citrus greening vector. This strategy is applicable to mitigating
the spread of CLaf and, in the event of CLas reaching South Africa, HLB in an African setting.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Sitrusvergroeningssiekte is ‘n ongeneesbare en vernietigende bakteriële siekte wat veroorsaak word deur spesies van floeëmbeperkte Candidatus Liberibacters. Die bakterieë word oorgedra deur twee insekte, Diaphorina citri en Trioza erytreae, waneer hulle op floeëm sap voed. Sitrusvergroeningssiekte is ‘n voortdurende bedreiging vir die sukses en stabiliteit van sitrusverbouing regoor die wêreld. Die insek-patogeen kombinasie van D. citri en Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), wat verantwoordelik is vir die ernstigste tipe sitrusvergroening, Huanglongbing (HLB), is onderskeidelik in 2016 en 2010 vir die eerste keer in Noord-Amerika gewaar. Die risiko dat HLB Suid-Afrika bereik is drasties verhoog toe daar bevestig is dat T. erytreae, die endemiese insek vektor van Candidatus Liberibacter africaus (CLaf), ook CLas kan oordra. Totdat daar ‘n behandeling vir HLB gevind word, is dit uiters belangrik dat ‘n betroubare strategie ontwikkel word om die insek vektor te beheer. Hierdie studie het gepoog om ‘n infektiewe kloon van die citrus tristeza virus (CTVfl6) te omskep in ‘n virus-geïnduseerde geenonderdrukking (VIGS) vektor wat noodsaaklike gene van die insek vektore van sitrusvergroeningssiekte teiken, en om bioinformaties ‘n profiel saam te stel van die virus-geïnduseerde kort inmengende RNA’s (vsiRNAs) wat in planta vervaardig word. Hierdie beheerstrategie is uitsonderlik spesifiek as gevolg van die volgordespesifieke meganisme van RNA inmenging (RNAi) masjienerie, asook die feit dat CTV ‘n floeëmbeperkte virus is. Vier potensiële gene, arginine kinase, abnormal wing disc, chitin synthase en ran-GTPase, is gekies om as teikens vir RNAi te dien. ‘n Versameling van ses insek- en geenspesifieke onderdrukkingsinvoegsels is geskep. ‘n Databasis van 24 intermediêre plasmiede, wat elk die 3’ eindpunt van CTVfl6 met een van die onderdrukkings invoegsels in die sin of teensin oriëntasie, met of sonder ‘n stroomop kopie van die CTV mantelproteïen beheerkomponent bevat, is gevestig. Die doel hiervan was om die invloed van die samestelling van die CTV VIGS vektor op vsiRNA vervaardiging in planta te evalueer. Daar is gepoog om die volledige CTVfl6 VIGS vektore aan mekaar te sit deur die 3` eindpunt van die oorspronklike genoomvolgorde te vervang met die nuutgestigte 3’ eindpunte. Slegs drie van die 24 is suksesvol gekonstrueer: twee T. erytreae insek- spesifieke, en een abnormal wing disc geen-spesifieke vektor. Al die CTVfl6 VIGS vektore het sistemiese infeksie bereik in 22% tot 33% van Nicotiana benthamiana plante 5-6 weke ná Agrobacterium tumefaciens infiltrasie. Daar is ook gepoog om Meksikaanse lemmetjie plante met twee van die drie CTVfl6 VIGS vektore te inokuleer. Kort RNA (sRNA) volgordebepaling is uitgevoer op CTV positiewe N. benthamiana materiaal, aangesien CTV infeksie nie in die meksikaanse lemmetjie plante bevestig kon word ten tyde monsters geneem is nie. Bioinformatiese analise van die N. benthamiana sRNA biblioteke het getoon dat vsiRNAs wat >99% van die CTVfl5 VIGS vektor genome dek, vervaardig is. Interaksie tussen die gasheerplant en die virus is aangedui deur ‘n toename in vsiRNA belyningsdiepte wat by twee van die geenonderdrukkers van CTV gesien kon word. Die mees betekenisvolle bevinding wat gemaak kon word deur na die samestelling van die vsiRNA profiele van die CTVfl6 VIGS vektore te kyk was dat CTVfl6 groot eksogene invoegings in die 3’ eindpunt kan hanteer. Infeksie met die CTVfl6 VIGS vektore het gelei tot die produksie van insek-spesifieke vsiRNAs in planta wat >99.78% van die onderdrukkingsinvoegsel dek. Hierdie studie was die eerste in sy soort om van hierdie RNAi strategie gebruik te maak om potensieel die endemiese Suid-Afrikaanse sitrusvergroeningssieke insek vektor, T. erytreae, te beheer. Ongeag of CLas Suid-Afrika bereik, sal die CTV VIGS vektore wat in hierdie studie geskep is toegepas kan word om die verspreiding van CLaf en sitrusvergroeningssiekte in ‘n Afrika omgewing te beperk.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Sitrusvergroeningssiekte is ‘n ongeneesbare en vernietigende bakteriële siekte wat veroorsaak word deur spesies van floeëmbeperkte Candidatus Liberibacters. Die bakterieë word oorgedra deur twee insekte, Diaphorina citri en Trioza erytreae, waneer hulle op floeëm sap voed. Sitrusvergroeningssiekte is ‘n voortdurende bedreiging vir die sukses en stabiliteit van sitrusverbouing regoor die wêreld. Die insek-patogeen kombinasie van D. citri en Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), wat verantwoordelik is vir die ernstigste tipe sitrusvergroening, Huanglongbing (HLB), is onderskeidelik in 2016 en 2010 vir die eerste keer in Noord-Amerika gewaar. Die risiko dat HLB Suid-Afrika bereik is drasties verhoog toe daar bevestig is dat T. erytreae, die endemiese insek vektor van Candidatus Liberibacter africaus (CLaf), ook CLas kan oordra. Totdat daar ‘n behandeling vir HLB gevind word, is dit uiters belangrik dat ‘n betroubare strategie ontwikkel word om die insek vektor te beheer. Hierdie studie het gepoog om ‘n infektiewe kloon van die citrus tristeza virus (CTVfl6) te omskep in ‘n virus-geïnduseerde geenonderdrukking (VIGS) vektor wat noodsaaklike gene van die insek vektore van sitrusvergroeningssiekte teiken, en om bioinformaties ‘n profiel saam te stel van die virus-geïnduseerde kort inmengende RNA’s (vsiRNAs) wat in planta vervaardig word. Hierdie beheerstrategie is uitsonderlik spesifiek as gevolg van die volgordespesifieke meganisme van RNA inmenging (RNAi) masjienerie, asook die feit dat CTV ‘n floeëmbeperkte virus is. Vier potensiële gene, arginine kinase, abnormal wing disc, chitin synthase en ran-GTPase, is gekies om as teikens vir RNAi te dien. ‘n Versameling van ses insek- en geenspesifieke onderdrukkingsinvoegsels is geskep. ‘n Databasis van 24 intermediêre plasmiede, wat elk die 3’ eindpunt van CTVfl6 met een van die onderdrukkings invoegsels in die sin of teensin oriëntasie, met of sonder ‘n stroomop kopie van die CTV mantelproteïen beheerkomponent bevat, is gevestig. Die doel hiervan was om die invloed van die samestelling van die CTV VIGS vektor op vsiRNA vervaardiging in planta te evalueer. Daar is gepoog om die volledige CTVfl6 VIGS vektore aan mekaar te sit deur die 3` eindpunt van die oorspronklike genoomvolgorde te vervang met die nuutgestigte 3’ eindpunte. Slegs drie van die 24 is suksesvol gekonstrueer: twee T. erytreae insek- spesifieke, en een abnormal wing disc geen-spesifieke vektor. Al die CTVfl6 VIGS vektore het sistemiese infeksie bereik in 22% tot 33% van Nicotiana benthamiana plante 5-6 weke ná Agrobacterium tumefaciens infiltrasie. Daar is ook gepoog om Meksikaanse lemmetjie plante met twee van die drie CTVfl6 VIGS vektore te inokuleer. Kort RNA (sRNA) volgordebepaling is uitgevoer op CTV positiewe N. benthamiana materiaal, aangesien CTV infeksie nie in die meksikaanse lemmetjie plante bevestig kon word ten tyde monsters geneem is nie. Bioinformatiese analise van die N. benthamiana sRNA biblioteke het getoon dat vsiRNAs wat >99% van die CTVfl5 VIGS vektor genome dek, vervaardig is. Interaksie tussen die gasheerplant en die virus is aangedui deur ‘n toename in vsiRNA belyningsdiepte wat by twee van die geenonderdrukkers van CTV gesien kon word. Die mees betekenisvolle bevinding wat gemaak kon word deur na die samestelling van die vsiRNA profiele van die CTVfl6 VIGS vektore te kyk was dat CTVfl6 groot eksogene invoegings in die 3’ eindpunt kan hanteer. Infeksie met die CTVfl6 VIGS vektore het gelei tot die produksie van insek-spesifieke vsiRNAs in planta wat >99.78% van die onderdrukkingsinvoegsel dek. Hierdie studie was die eerste in sy soort om van hierdie RNAi strategie gebruik te maak om potensieel die endemiese Suid-Afrikaanse sitrusvergroeningssieke insek vektor, T. erytreae, te beheer. Ongeag of CLas Suid-Afrika bereik, sal die CTV VIGS vektore wat in hierdie studie geskep is toegepas kan word om die verspreiding van CLaf en sitrusvergroeningssiekte in ‘n Afrika omgewing te beperk.
Description
Thesis (MScAgric)--Stellenbosch University, 2022.
Keywords
Genetic vectors, Biotechnology, Citrus tristeza disease -- South Africa, Citrus greening disease -- Control, Citrus tristeza virus (CTV) -- Genetic aspects, Citrus -- Diseases and pests -- Genetic aspects, Small interfering RNA, Gene silencing, UCTD