Investigation of protein complexes involved in coenzyme A biosynthesis
Date
2022-12
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: The biochemistry of the CoA biosynthetic pathway has been extensively studied and the differences
in how the pathway functions between domains of life has led to its validation in recent years as
target for drug development against many infectious disease-causing organisms. However, the
structural organization of the CoA biosynthetic machinery remains to be investigated. Compelling
evidence of a potential CoA-synthesizing protein complex (CoA-SPC) in yeast was recently
demonstrated by pairwise interaction studies of the CoA biosynthetic enzymes from Saccharomyces
cerevisiae which were found to interact with each other. In bacteria, the formation of a CoA
biosynthetic enzyme complex has not been reported. However, the elucidation of the Mycobacterium
smegmatis CoaBC (MsmCoaBC) structure and the recent findings showing CoaBC to be a vulnerable point
in the CoA pathway suggested that it could form the basis for the formation of such complexes in
bacteria.
The first aim of this study focused on the isolation of the proposed CoA-SPC from S. cerevisiae and
its characterisation by means of affinity pull-down assays. In this investigation, we were able to
successfully overexpress yeast-related CoA biosynthetic proteins but unsuccessful in isolating the
CoA-SPC from yeast lysate using pull-downs. High performance liquid chromatography (HPLC) was
performed as an alternative means to assay for CoA formation by partially purified yeast protein
samples. However, no detectable amounts of CoA were observed in the samples after repeated
attempts. As CoA is readily detected within yeast lysates, we speculate that errors in either the
preparation methods or assays procedure is a result that hindered our progress. Overall, as this
complex has not yet been isolated before, the conditions that would lead to its formation could
impact its overall isolation and therefore needs to be further explored.
In the second aim, we explored the concept of a CoA biosynthetic complex in bacteria by
investigating the structure of the bi-functional CoaBC of Staphylococcus aureus utilising single
particle electron microscopy techniques. We were able to produce a low-resolution model of the S.
aureus CoaBC (SaCoaBC) at ~20Å under negative stain conditions. Two distinct models were
reconstructed with one accommodating the overall architecture of MsmCoaBC and the other
significantly different along its vertices. 3D classifications were unable to clearly establish
that the two models are a result of a true conformational change. A detailed single particle
cryo-EM study is necessary to determine this, and it will also contribute greatly to the proposed
idea of multiple conformations within the CoaBC structure.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Die biochemie van die CoA biosintetiese pad is omvattend bestudeer en die verskille in hoe die pad funksioneer tussen lewensdomeine het in onlangse jare gelei tot die validering daarvan as teiken vir geneesmiddelontwikkeling teen verskeie aansteeklike siekte- veroorsakende organismes. Die strukturele organisasie van die CoA biosintetiese masjinerie moet egter nog ondersoek word. Dwingende bewyse van 'n potensiële KoA-sintetiserende proteïenkompleks (CoA-SPC) in gis is onlangs gelewer deur paargewyse interaksiestudies van die KoA biosintetiese ensieme van Saccharomyces cerevisiae wat gevind is om met mekaar te reageer. By bakterieë is die vorming van 'n KoA biosintetiese ensiemkompleks nog nie aangemeld nie. Die oplossing van die Mycobacterium smegmatis CoaBC (MsmCoaBC) struktuur en die onlangse bevindinge waarin CoaBC as 'n kwesbare punt in die KoA-padweg uitgelig is, het egter aangewys dat dit die basis kan wees vir die vorming van sulke komplekse in bakterieë. Die eerste doel van hierdie studie het gefokus op die isolasie van die voorgestelde CoA-SPC van S. cerevisiae en die karakterisering daarvan deur middel van affiniteits-uittrektoetse. In hierdie ondersoeke was ons in staat om gisverwante KoA biosintetiese proteïene suksesvol uit te druk, maar onsuksesvol in die isolering van die KoA-SPC vanuit gislisaat. Hoëprestasie vloeistofchromatografie (HPLC) is gebruik as 'n alternatiewe manier om vir KoA-vorming deur gedeeltelik gesuiwerde gisproteïenmonsters. Geen waarneembare hoeveelhede KoA is egter in die monsters na herhaalde pogings waargeneem nie. Aangesien CoA geredelik binne gislisate opgespoor kan word, spekuleer ons dat foute in óf die voorbereidingsmetodes óf toetsprosedure 'n resultaat is wat ons vordering belemmer het. Oor die algemeen, aangesien hierdie kompleks nog nie voorheen geïsoleer is nie, kan die toestande wat tot sy vorming sou lei, die algehele isolasie daarvan beïnvloed en moet dus verder ondersoek word. In die tweede doel het ons die voorstel van 'n KoA biosintetiese kompleks in bakterieë ondersoek deur die struktuur van die bi-funksionele KoaBC van Staphylococcus aureus te ondersoek deur gebruik te maak van enkeldeeltjieelektronmikroskopie-tegnieke. Ons was in staat om 'n lae-resolusie model van die S. aureus CoaBC (SaCoaBC) te produseer by ~20Å onder negatiewe kleur toestande. Twee verskillende modelle is gerekonstrueer met een wat die algehele argitektuur van MsmCoaBC akkommodeer en die ander beduidend verskillend langs sy hoekpunte. 3D-klassifikasies kon nie duidelik vasstel of die twee modelle die gevolg is van 'n ware konformasieverandering nie. 'n Gedetailleerde enkeldeeltjie-krio-EM-studie is nodig om dit te bepaal, en dit sal ook grootliks bydra tot die voorgestelde idee van meervoudige konformasies binne die CoaBC-struktuur.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Die biochemie van die CoA biosintetiese pad is omvattend bestudeer en die verskille in hoe die pad funksioneer tussen lewensdomeine het in onlangse jare gelei tot die validering daarvan as teiken vir geneesmiddelontwikkeling teen verskeie aansteeklike siekte- veroorsakende organismes. Die strukturele organisasie van die CoA biosintetiese masjinerie moet egter nog ondersoek word. Dwingende bewyse van 'n potensiële KoA-sintetiserende proteïenkompleks (CoA-SPC) in gis is onlangs gelewer deur paargewyse interaksiestudies van die KoA biosintetiese ensieme van Saccharomyces cerevisiae wat gevind is om met mekaar te reageer. By bakterieë is die vorming van 'n KoA biosintetiese ensiemkompleks nog nie aangemeld nie. Die oplossing van die Mycobacterium smegmatis CoaBC (MsmCoaBC) struktuur en die onlangse bevindinge waarin CoaBC as 'n kwesbare punt in die KoA-padweg uitgelig is, het egter aangewys dat dit die basis kan wees vir die vorming van sulke komplekse in bakterieë. Die eerste doel van hierdie studie het gefokus op die isolasie van die voorgestelde CoA-SPC van S. cerevisiae en die karakterisering daarvan deur middel van affiniteits-uittrektoetse. In hierdie ondersoeke was ons in staat om gisverwante KoA biosintetiese proteïene suksesvol uit te druk, maar onsuksesvol in die isolering van die KoA-SPC vanuit gislisaat. Hoëprestasie vloeistofchromatografie (HPLC) is gebruik as 'n alternatiewe manier om vir KoA-vorming deur gedeeltelik gesuiwerde gisproteïenmonsters. Geen waarneembare hoeveelhede KoA is egter in die monsters na herhaalde pogings waargeneem nie. Aangesien CoA geredelik binne gislisate opgespoor kan word, spekuleer ons dat foute in óf die voorbereidingsmetodes óf toetsprosedure 'n resultaat is wat ons vordering belemmer het. Oor die algemeen, aangesien hierdie kompleks nog nie voorheen geïsoleer is nie, kan die toestande wat tot sy vorming sou lei, die algehele isolasie daarvan beïnvloed en moet dus verder ondersoek word. In die tweede doel het ons die voorstel van 'n KoA biosintetiese kompleks in bakterieë ondersoek deur die struktuur van die bi-funksionele KoaBC van Staphylococcus aureus te ondersoek deur gebruik te maak van enkeldeeltjieelektronmikroskopie-tegnieke. Ons was in staat om 'n lae-resolusie model van die S. aureus CoaBC (SaCoaBC) te produseer by ~20Å onder negatiewe kleur toestande. Twee verskillende modelle is gerekonstrueer met een wat die algehele argitektuur van MsmCoaBC akkommodeer en die ander beduidend verskillend langs sy hoekpunte. 3D-klassifikasies kon nie duidelik vasstel of die twee modelle die gevolg is van 'n ware konformasieverandering nie. 'n Gedetailleerde enkeldeeltjie-krio-EM-studie is nodig om dit te bepaal, en dit sal ook grootliks bydra tot die voorgestelde idee van meervoudige konformasies binne die CoaBC-struktuur.
Description
Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2022.
Keywords
Biochemistry, Coenzyme A biosynthesis -- Biotechnology, Saccharomyces cerevisiae, Yeast -- Purification, UCTD