The carriage of antimicrobial resistance genes in children from Cape Town communities.
Date
2022-12
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Introduction: The human microbiota is a rich source of microbial diversity and an accessible reservoir of antibiotic resistance genes (ARGs). The collection of ARGs present in the microbiota has been termed the resistome. Antibiotic use is a major driver of antibiotic resistance (ABR) and selection of ARGs. There is limited surveillance data on ABR in undercharacterized populations, particularly in children, in the community and in developing countries. A collection of stool specimens collected from healthy children as part of the Tuberculosis Child Multidrug-resistant Preventive Therapy Trial, which evaluates the efficacy of levofloxacin as prophylaxis in multidrug-resistant tuberculosis exposed children, provides an opportunity to describe the carriage of ARGs in a population of healthy children in the community. Methods: Fifty baseline stool samples from children in Cape Town communities that are part of the TB CHAMP trail, collected from November 2017 to July 2018, were used in this substudy for resistome analysis. Both targeted and functional metagenomics (FM) approaches were used to investigate the resistome. The blaCTX-M-1, -9 and -B (2, -8 and -25) genes were detected with real-time PCR in fifty stool samples. Conventional PCR was used to identify blaSHV and blaTEM genes. A FM approach was developed to detect ARGs from stool samples. DNA was extracted from five stool samples, fragmented and end repaired. Fragmented DNA between 1500 - 8000 bp was selected and ligated into the Eco53KI site in plasmid pHSG298, a plasmid vector with kanamycin as selectable marker. The ligation mix was transformed into chemically competent DH5α Escherichia coli cells, blue-white colony screening was performed, and all white colonies were stored, creating a metagenomic library from each stool sample. The FM libraries were plated on selected antibiotics and Sanger sequencing was used to identify the inserts from resistant colonies. Results: blaCTX-M-1 (72%) was present in more samples than blaCTX-M-9 (8%). SHV and TEM were present in 64% and 100% of the samples, respectively. The FM libraries created ranged from 1.7 x 106 to 2.5 x 107 bp in size. Resistant colonies were detected on media containing ampicillin, amikacin and cefotaxime. Sequencing results identified known ARGs, including an aminoglycoside adenylyl transferase gene selected on the amikacin-containing agar plates and a MATE family efflux pump from the ampicillin-containing agar plates. Various resistance associated and potential resistance proteins were also detected. Conclusion:
blaCTX-M-1 was the commonest ESBL, in line with global trends. When compared to a culture-based study on bacterial isolates from the same samples; beta-lactamase genes were detected more commonly using targeted PCR than by culture The high prevalence of ESBL genes in samples from the community is concerning and supports the concept of microbiota acting as a reservoir of resistance genes. We have also developed a FM approach to detect ARGs from stool samples, which is able to identify known and potentially novel resistance mechanisms. This study has contributed to our knowledge of ARGs in under characterized populations in Cape Town.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Agtergrond: Die menslike mikrobiota is ‘n ryk bron van mikrobiese diversiteit en ‘n toeganklike reservoir van antibiotika weerstandigheidsgene (AWG’s). Die versameling van AWG’s wat in die mikrobiota teenwoordig is, word die resistoom genoem. Die gebruik van antibiotika is ‘n belangrike drywer van antibiotika weerstandigheid (ABW). Daar is beperkte toesigdata oor ABW in onder gekarakteriseerde bevolkings, soos kinders, in die gemeenskap en in ontwikkelende lande. ‘n Versameling van stoelgangmonsters wat van gesonde kinders ontvang is as deel van die “Tuberculosis Child Multidrug-resistant Preventive Therapy Trial”, wat die effektiwiteit van levofloxacin as voorkomende terapie in kinders met huishoudelike tuberkulose kontak evalueer. Die studie bied ‘n geleentheid om die teenwordigheid van AWG’s in ‘n bevolking van gesonde kinders in die gemeenskap te beskryf. Metodes: Vyftig basislyn stoelgangmonsters is ontvang van kinders in Kaapstad gemeenskappe wat deel vorm van die TB CHAMP studie, gekolekteer vanaf November 2017 tot Julie 2018, is gebruik vir die studie. ‘n Geteikende en funksionele metagenomika (FM) benaderinge is gebruik om weerstandheid te ondersoek. Die blaCTX-M-1, -9 en B (2, -8 en -25) gene is opgespoor met teenwordige tyd PKR en; die relatiewe hoeveelheid van CTX-M-1 en -9 is bepaal. Konvensionele PKR is gebruik om blaSHV- en blaTEM-gene te identifiseer. Ons het ‘n FM benadering ontwikkel om AWG’s in stoelgangmonsters op te spoor. In die konteks van resistoom analise maak FM voorsiening vir die opsporing van AWG’s sonder vooraf kennis van hul DNS volgordebeplaing. DNS uit ‘n stoelgangmonster onttrek, gefragmenteerd en dieeind punte herstel. DNS-groottes tussen 1500 – 8000 bases pare is gekies ingevoeg in ‘n plasmiedvektor pHSG298, met kanamysin as selekteerbare merker, wat gesny is met Eco53KI-restriksie ensiem. Die ligeerde reaksie is geplaas in chemiese bekwame DH5α Escherichia coli-selle, blou – wit kolonie kiesing is uitgevoer, en alle wit kolonies is geberg en ‘n metagenomiese biblioteek geskep. Vyf FM-biblioteke is geskep. Die FM-biblioteke is op verskillende antibiotika plate getoets en Sanger volgordebepaling is gebruik om die insetsels van weerstandige kolonies te identifiseer. Resultate: blaCTX-M-1 (72%) was teenwoordig in meer monsters blaCTX-M-9(8%). SHV en TEM was onderskeidelik in 64% en 100% van die monsters teenwoordig. Die FM-biblioteke wat geskep is, het gewissel van 1,7 x 106 tot 2,5 x 107 bp in grootte. Weerstandige kolonies is op media opgespoor wat ampisillien, amikacin en cefotaxime bevat. Die DNS volgorde van die resultate het bekende AWG's geïdentifiseer, 'n aminoglikosied-adenyl-oordraggeen op die amikacin plate en 'n MATE-familie-uitvloeipomp op die ampisillien plate en verskillende weerstand geassosieerde en potensiële gene is gevind. Gevolgtrekking: blaCTX-M-1 was die algemeenste ESBL, in oreenstemming met die resultate van regoor die wêreld. Die hoë voorkoms van ESBL-gene in monsters uit die gemeenskap is kommerwekkend en ondersteun die konsep van die mikrobioom as 'n reservoir van weerstandigheidsgene optree. Ons het ook 'n FM-benadering ontwikkel om AWG's op te spoor in stoelgangmonsters wat bekende en “potensiele” nuwe weerstandsmeganismes kan identifiseer. Hierdie studie het bygedra tot ons kennis van AWG's in onder -gekarakteriseerde bevolkings in Kaapstad.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Agtergrond: Die menslike mikrobiota is ‘n ryk bron van mikrobiese diversiteit en ‘n toeganklike reservoir van antibiotika weerstandigheidsgene (AWG’s). Die versameling van AWG’s wat in die mikrobiota teenwoordig is, word die resistoom genoem. Die gebruik van antibiotika is ‘n belangrike drywer van antibiotika weerstandigheid (ABW). Daar is beperkte toesigdata oor ABW in onder gekarakteriseerde bevolkings, soos kinders, in die gemeenskap en in ontwikkelende lande. ‘n Versameling van stoelgangmonsters wat van gesonde kinders ontvang is as deel van die “Tuberculosis Child Multidrug-resistant Preventive Therapy Trial”, wat die effektiwiteit van levofloxacin as voorkomende terapie in kinders met huishoudelike tuberkulose kontak evalueer. Die studie bied ‘n geleentheid om die teenwordigheid van AWG’s in ‘n bevolking van gesonde kinders in die gemeenskap te beskryf. Metodes: Vyftig basislyn stoelgangmonsters is ontvang van kinders in Kaapstad gemeenskappe wat deel vorm van die TB CHAMP studie, gekolekteer vanaf November 2017 tot Julie 2018, is gebruik vir die studie. ‘n Geteikende en funksionele metagenomika (FM) benaderinge is gebruik om weerstandheid te ondersoek. Die blaCTX-M-1, -9 en B (2, -8 en -25) gene is opgespoor met teenwordige tyd PKR en; die relatiewe hoeveelheid van CTX-M-1 en -9 is bepaal. Konvensionele PKR is gebruik om blaSHV- en blaTEM-gene te identifiseer. Ons het ‘n FM benadering ontwikkel om AWG’s in stoelgangmonsters op te spoor. In die konteks van resistoom analise maak FM voorsiening vir die opsporing van AWG’s sonder vooraf kennis van hul DNS volgordebeplaing. DNS uit ‘n stoelgangmonster onttrek, gefragmenteerd en dieeind punte herstel. DNS-groottes tussen 1500 – 8000 bases pare is gekies ingevoeg in ‘n plasmiedvektor pHSG298, met kanamysin as selekteerbare merker, wat gesny is met Eco53KI-restriksie ensiem. Die ligeerde reaksie is geplaas in chemiese bekwame DH5α Escherichia coli-selle, blou – wit kolonie kiesing is uitgevoer, en alle wit kolonies is geberg en ‘n metagenomiese biblioteek geskep. Vyf FM-biblioteke is geskep. Die FM-biblioteke is op verskillende antibiotika plate getoets en Sanger volgordebepaling is gebruik om die insetsels van weerstandige kolonies te identifiseer. Resultate: blaCTX-M-1 (72%) was teenwoordig in meer monsters blaCTX-M-9(8%). SHV en TEM was onderskeidelik in 64% en 100% van die monsters teenwoordig. Die FM-biblioteke wat geskep is, het gewissel van 1,7 x 106 tot 2,5 x 107 bp in grootte. Weerstandige kolonies is op media opgespoor wat ampisillien, amikacin en cefotaxime bevat. Die DNS volgorde van die resultate het bekende AWG's geïdentifiseer, 'n aminoglikosied-adenyl-oordraggeen op die amikacin plate en 'n MATE-familie-uitvloeipomp op die ampisillien plate en verskillende weerstand geassosieerde en potensiële gene is gevind. Gevolgtrekking: blaCTX-M-1 was die algemeenste ESBL, in oreenstemming met die resultate van regoor die wêreld. Die hoë voorkoms van ESBL-gene in monsters uit die gemeenskap is kommerwekkend en ondersteun die konsep van die mikrobioom as 'n reservoir van weerstandigheidsgene optree. Ons het ook 'n FM-benadering ontwikkel om AWG's op te spoor in stoelgangmonsters wat bekende en “potensiele” nuwe weerstandsmeganismes kan identifiseer. Hierdie studie het bygedra tot ons kennis van AWG's in onder -gekarakteriseerde bevolkings in Kaapstad.
Description
Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2022.