Employing omics to investigate the macrophage response to infection with pathogenic and non-pathogenic mycobacteria
Date
2021-10
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Tuberculosis kills more than a million people each year and its lengthy treatment is complicated by drug resistant variants of Mycobacterium tuberculosis. Pathogenic mycobacteria have the ability to survive inside its human hosts and use the host’s own molecules to subvert host defences and avoid normal macrophage functions that normally contain and kill invading bacteria. New drug and drug targets as well as treatment options are continuously being sought to eradicate tuberculosis. One possible means of treatment is to target host molecules through the use of host directed therapeutics to stop or disrupt the pathogenic mycobacteria from using host molecules for its intracellular survival. Host-directed therapeutics (HDTs) have the advantage of not being subjected to drug resistance. HDTs are synthetically produced and can act to supress, through the use of siRNA (short interfering RNA), or activate, through the use of saRNA (short activating RNA), the expression of genes. Changing the expression level of a specific host gene can lead to the intracellular killing of pathogenic mycobacteria. Two separate studies using siRNA demonstrated that by enhancing the process of autophagy, which can overcome the blocking effect on phagosome maturation, resulted in decreased intracellular growth of the mycobacteria. Previous research indicates that the culturing of mycobacteria in the presence of detergents like Tween-80 disrupts the mycobacterial capsule and results in a different host response. This has an important implication in that mycobacteria proliferate and spread in the absence of detergent inside humans and mimicking this detergent-free state in the macrophage infection model, might elucidate drug targets that can be overlooked otherwise. To investigate the effect of Tween-80 on mycobacteria, a metabolomics study was performed to compare mycobacteria cultured in the presence and absence of Tween-80. Metabolome variations were seen for both Mtb H37Rv and R179 cultured in the presence of Tween-80. Overall, various metabolites were up-regulated but significantly more for H37Rv as compared to R179. Tween-80 provided an additional carbon source that caused a shift in the central carbon metabolism and hence a different metabolic profile. These results gave strong evidence to support the exclusion of detergent from mycobacterial cultures that will be used for macrophage infections. The effect of detergent was also tested on the response of macrophages by infecting mouse bone marrow-derived macrophages (BMDMs) with R179 grown in the presence and absence of Tween-80 and analysing the macrophage transcriptome through high throughput (RNA-Seq). The transcriptome profile for the BMDMs was different between infection with R179 cultured with and without Tween-80. Furthermore, while an overall down-regulation of genes were observed for infection with mycobacteria grown in Tween-80, the detergent-free cultured Mtb provoked a largely up-regulation of genes as well as a strong proinflammatory response. This demonstrated that it is important to exclude the use of detergents in the culturing of mycobacteria that will be used for infection studies. The current project aimed to identify differentially expressed genes in host cells between infection with pathogenic (Mtb H37Rv and Beijing clinical isolate R179) and non-pathogenic (M. smegmatis and M. bovis BCG) mycobacteria. The virulence level differ between these species. To ascertain if virulence could have an impact on the macrophage response, BMDMs were infected with Beijing Mtb clinical isolates R5527 (hyper-virulent) or R1507 (hypo-virulent). The macrophage responses were compared through transcriptomics profiles and showed differences for infection between hypo-and hyper-virulent Mtb. Prominent differences were revealed in the cytokine and chemokine levels induced between the hypo- and hyper-virulent Mtb, including pro-inflammatory cytokines IL- 1β, IL-6, IL-12β and the chemokine RANTES (CCL5). It could therefore be expected to find differentially expressed host genes in the comparison between the 4 mycobacterial species. The approach for identifying molecules that are potentially involved in the intracellular survival of mycobacteria, was to compare the macrophage response to infection between non-pathogenic mycobacteria (M. smegmatis and M. bovis BCG) that are normally killed inside macrophages and pathogenic mycobacteria (Mtb H37Rv and Beijing clinical isolate R179) that normally survive inside macrophages. The aim was to identify macrophage molecules that are differentially expressed between infection with pathogenic and non-pathogenic mycobacteria. Mouse bone marrow-derived macrophages were infected with mycobacteria that were cultured in the absence of detergent. RNA-Seq was used to determine the expression levels of genes by measuring mRNA transcripts. The focus was placed on genes that were differentially expressed when macrophages were infected with pathogenic mycobacteria and having a fold change of 2 or more. These genes were shortlisted and validated through qPCR. Pathway analysis (using STRING) revealed that genes having an antiviral function and induced by interferon signalling featured strongly among the differentially expressed genes. This list included mouse Mx genes that do not code for functional proteins. This lead to the study shifting to a human macrophage cell-based model to test the selected genes for their potential role in the intracellular survival of mycobacteria. Selected genes included MX1, MX2, IFITM1, IFITM3, OAS1, OAS2 and OAS3. BCG-infection could be grouped together with the response under infection with the pathogenic strains and was therefore used an indicator for infection with the pathogenic species. Gene expression levels were knocked down or up through the use of siRNA or non-viral vectors respectively to test if any of the genes of interest play a role in the intracellular survival of mycobacteria. Knocking down MX2 in M. smegmatis-infected THP-1 macrophages caused increased intracellular bacterial growth. The knock-down of IFITM1 and IFITM3 in M. smegmatis infected macrophages resulted in the same trend of increased intracellular growth. The same type of observation was made in a related published study for the knocking down of OAS genes for which it was concluded that these differentially expressed genes with an antiviral role also seem to have a protective role during mycobacterial infections. In contrast, knocking up the expression of MX1 and OAS3 in BCG-infected macrophages caused a significant reduction in the number of intracellular mycobacteria. The simultaneous treatment of BCG-infected macrophages with MX1 and OAS3 vectors resulted in a highly significant decrease in CFU at 48 hours post-infection as compared to the untreated control. This result is therefore in line with previously published genes that have an antiviral role in host cells and also being protective against mycobacteria. MX1 and OAS3 could be promising candidates if explored as targets in host-directed therapies against tuberculosis.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Tuberkulose maak jaarliks meer as 'n miljoen mense dood en die langdurige behandeling daarvan word bemoeilik deur dwelmweerstandige variante van Mycobacterium tuberculosis. Patogeniese mikobakterieë het die vermoë om binne sy menslike gashere te oorleef en die gasheer se eie molekules te gebruik om die gasheer se verdediging te ondermyn en normale makrofage -funksies te vermy wat normaalweg indringende bakterieë isoleer en doodmaak. Daar word voortdurend gesoek na nuwe medisyne en medisyne-teikens sowel as behandelingsopsies om tuberkulose uit te wis. Een moontlike behandelingsmiddel is om gasheer-molekules te teiken deur die gebruik van gasheergerigte terapieë om sodoende die patogeniese mikobakterieë te stop of te ontwrig om gasheermolekules te gebruik vir sy intrasellulêre oorlewing. Gasheergerigte terapieë (HDT's) het die voordeel dat hulle nie blootgestel word aan geneesmiddelweerstandigheid nie. HDT's word sinteties vervaardig en kan optree om die uitdrukking van gene te onderdruk deur die gebruik van siRNA (klein onderdrukkende RNS), of deur die gebruik van saRNA (klein aktiverende RNS). Die verandering van die uitdrukkingsvlak van 'n spesifieke gasheergeen kan lei tot die intrasellulêre dood van patogeniese mykobakterieë. Twee afsonderlike studies met siRNA het getoon dat die versterking van die proses van outofagie, wat die blokkasie op fagosoomveroudering kan oorkom, gelei het tot verminderde intrasellulêre groei van die mykobakterieë. Vorige navorsing dui aan dat die kweek van mykobakterieë in die teenwoordigheid van skoonmaakmiddels soos Tween-80 die mikobakteriese kapsule versteur en 'n ander reaksie op die gasheer tot gevolg het. Dit het 'n belangrike implikasie deurdat mykobakterieë vermeerder en versprei in die afwesigheid van skoonmaakmiddel in die mens en die nabootsing van hierdie skoonmaakmiddelvrye toestand in die makrofage-infeksiemodel, kan geneesmiddeldoelwitte verduidelik wat andersins misgekyk kan word. Om die effek van Tween-80 op mykobakterieë te ondersoek, is 'n metabolomiese studie uitgevoer om mykobakterieë wat in die teenwoordigheid en afwesigheid van Tween-80 gekweek word, te vergelyk. Metaboloom variasies is gesien vir beide Mtb H37Rv en R179 gekweek in die teenwoordigheid van Tween-80. In die algemeen is verskillende metaboliete opreguleer, maar aansienlik meer vir H37Rv in vergelyking met R179. Tween-80 bied 'n ekstra koolstofbron wat 'n verskuiwing in die sentrale koolstofmetabolisme veroorsaak het en dus 'n ander metaboliese profiel. Hierdie resultate het sterk bewyse gelewer om die uitsluiting van skoonmaakmiddel uit die mykobakteriese kulture wat vir makrofage -infeksies gebruik word, te ondersteun. Die effek van skoonmaakmiddel is ook getoets op die reaksie van makrofage deur makrofage van die muisbeenmurg (BMDM's) te infekteer met R179 wat gegroei was in die teenwoordigheid en afwesigheid van Tween-80 en die effek op die makrofagetranskriptoom deur hoë deurset (RNA-Seq) te analiseer. Die transkriptome profiel vir die BMDM's was anders tussen infeksie met R179, gekweek met en sonder Tween-80. Terwyl 'n algemene afregulering van gene waargeneem is vir infeksie met mikobakterieë wat in Tween-80 gegroei het, het die wasmiddelvrye gekweekte Mtb 'n grootliks opregulering van gene veroorsaak, sowel as 'n sterk pro-inflammatoriese reaksie. Dit het getoon dat dit belangrik is om die gebruik van skoonmaakmiddels by die kweek van mykobakterieë wat vir infeksiestudies gebruik gaan word, uit te sluit. Die huidige projek was daarop gemik om differensieel uitgedrukte gene in gasheerselle te identifiseer tussen infeksie met patogeniese (Mtb H37Rv en Beijing kliniese isolaat R179) en niepatogeniese (M. smegmatis en M. bovis BCG) mykobakterieë. Die virulensievlak verskil tussen hierdie spesies. Om vas te stel of virulensie 'n invloed op die makrofage-reaksie kan hê, is BMDM's geinfekteer met Beijing Mtb kliniese isolate R5527 (hiper-virulent) of R1507 (hipo-virulent). Die makrofage-reaksie is vergelyk deur middel van transkriptomiese profiele en het verskille getoon vir infeksie tussen hipo- en hiper-virulente Mtb. Prominente verskille is geopenbaar in die sitokienen chemokienvlakke wat veroorsaak word tussen die hipo- en hipervirulente Mtb, insluitend proinflammatoriese sitokiene IL-1β, IL-6, IL-12β en die chemokien RANTES (CCL5). Daar sou dus verwag kon word dat differensiaal uitgedrukte gasheergene gevind word in die vergelyking tussen die vier mykobakteriese spesies. Die benadering om molekules te identifiseer wat moontlik betrokke is by die intrasellulêre oorlewing van mykobakterieë, was om die makrofage-reaksie op infeksie tussen nie-patogeniese mykobakterieë (M. smegmatis en M. bovis BCG) wat normaalweg binne makrofage gedood word te vergelyk met patogeniese mykobakterieë (Mtb H37Rv en Beijing kliniese isolaat R179) wat normaalweg binne makrofage oorleef. Die doel was om makrofage-molekules te identifiseer wat differensieel tot uitdrukking kom tussen infeksie met patogeniese en nie-patogeniese mykobakterieë. Makrofage afkomstig van muisbeenmurg is geinfekteer met mykobakterieë wat in die afwesigheid van skoonmaakmiddel gekweek is. RNA-Seq is gebruik om die ekspressievlakke van gene te bepaal deur mRNA-transkripsies te meet. Die fokus is geplaas op gene wat differensieel tot uiting kom wanneer makrofage geïnfekteer is met patogeniese mykobakterieë en met 'n meervoudsverandering van 2 of meer. Hierdie gene is op die kortlys geplaas en gevalideer deur middel van qPCR. Padanalise (met behulp van STRING) het aan die lig gebring dat gene met 'n antivirale funksie en veroorsaak deur interferon -sein sterk onder die differensieel uitgedrukte gene verskyn. Hierdie lys bevat Mx -gene van muise wat nie vir funksionele proteïene kodeer nie. Dit het daartoe gelei dat die studie oorgegaan het na 'n model van 'n menslike makrofage-sel om die geselekteerde gene te toets vir hul potensiële rol in die intrasellulêre oorlewing van mykobakterieë. Geselekteerde gene sluit in MX1, MX2, IFITM1, IFITM3, OAS1, OAS2 en OAS3. BCG-infeksie kan saamgegroepeer word met die reaksie onder infeksie met die patogeniese stamme en is daarom gebruik as 'n aanduiding vir infeksie met die patogeniese spesies. Gene-uitdrukkingsvlakke is verlaag of verlaag deur die gebruik van onderskeidelik siRNA of nie-virale vektore om te toets of enige van die gene van belang 'n rol speel in die intrasellulêre oorlewing van mykobakterieë. Deur MX2 in M. smegmatis-geïnfekteerde THP-1-makrofage af te slaan, het verhoogde intrasellulêre bakteriegroei veroorsaak. Die onderdrukking van IFITM1 en IFITM3 in M. smegmatisgeïnfekteerde makrofage het dieselfde neiging tot verhoogde intrasellulêre groei tot gevolg gehad. Dieselfde tipe waarneming is gemaak in 'n verwante gepubliseerde studie oor die afbreek van OAS -gene waarvoor die gevolgtrekking gekom het dat hierdie differensieel uitgedrukte gene met 'n antivirale rol ook 'n beskermende rol speel tydens mikobakteriese infeksies. In teenstelling hiermee het die uitdrukking van MX1 en OAS3 in BCG-geïnfekteerde makrofage 'n aansienlike vermindering in die aantal intrasellulêre mykobakterieë veroorsaak. Die gelyktydige behandeling van BCG-geïnfekteerde makrofage met MX1- en OAS3-vektore het gelei tot 'n baie beduidende afname in CFU 48 uur na infeksie in vergelyking met die onbehandelde kontrole. Hierdie resultaat is dus in ooreenstemming met voorheen gepubliseerde gene wat 'n antivirale rol in gasheerselle speel en ook beskerm teen mikobakterieë. MX1 en OAS3 kan belowende kandidate wees as dit ondersoek word as teikens in gasheergerigte terapieë teen tuberkulose.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Tuberkulose maak jaarliks meer as 'n miljoen mense dood en die langdurige behandeling daarvan word bemoeilik deur dwelmweerstandige variante van Mycobacterium tuberculosis. Patogeniese mikobakterieë het die vermoë om binne sy menslike gashere te oorleef en die gasheer se eie molekules te gebruik om die gasheer se verdediging te ondermyn en normale makrofage -funksies te vermy wat normaalweg indringende bakterieë isoleer en doodmaak. Daar word voortdurend gesoek na nuwe medisyne en medisyne-teikens sowel as behandelingsopsies om tuberkulose uit te wis. Een moontlike behandelingsmiddel is om gasheer-molekules te teiken deur die gebruik van gasheergerigte terapieë om sodoende die patogeniese mikobakterieë te stop of te ontwrig om gasheermolekules te gebruik vir sy intrasellulêre oorlewing. Gasheergerigte terapieë (HDT's) het die voordeel dat hulle nie blootgestel word aan geneesmiddelweerstandigheid nie. HDT's word sinteties vervaardig en kan optree om die uitdrukking van gene te onderdruk deur die gebruik van siRNA (klein onderdrukkende RNS), of deur die gebruik van saRNA (klein aktiverende RNS). Die verandering van die uitdrukkingsvlak van 'n spesifieke gasheergeen kan lei tot die intrasellulêre dood van patogeniese mykobakterieë. Twee afsonderlike studies met siRNA het getoon dat die versterking van die proses van outofagie, wat die blokkasie op fagosoomveroudering kan oorkom, gelei het tot verminderde intrasellulêre groei van die mykobakterieë. Vorige navorsing dui aan dat die kweek van mykobakterieë in die teenwoordigheid van skoonmaakmiddels soos Tween-80 die mikobakteriese kapsule versteur en 'n ander reaksie op die gasheer tot gevolg het. Dit het 'n belangrike implikasie deurdat mykobakterieë vermeerder en versprei in die afwesigheid van skoonmaakmiddel in die mens en die nabootsing van hierdie skoonmaakmiddelvrye toestand in die makrofage-infeksiemodel, kan geneesmiddeldoelwitte verduidelik wat andersins misgekyk kan word. Om die effek van Tween-80 op mykobakterieë te ondersoek, is 'n metabolomiese studie uitgevoer om mykobakterieë wat in die teenwoordigheid en afwesigheid van Tween-80 gekweek word, te vergelyk. Metaboloom variasies is gesien vir beide Mtb H37Rv en R179 gekweek in die teenwoordigheid van Tween-80. In die algemeen is verskillende metaboliete opreguleer, maar aansienlik meer vir H37Rv in vergelyking met R179. Tween-80 bied 'n ekstra koolstofbron wat 'n verskuiwing in die sentrale koolstofmetabolisme veroorsaak het en dus 'n ander metaboliese profiel. Hierdie resultate het sterk bewyse gelewer om die uitsluiting van skoonmaakmiddel uit die mykobakteriese kulture wat vir makrofage -infeksies gebruik word, te ondersteun. Die effek van skoonmaakmiddel is ook getoets op die reaksie van makrofage deur makrofage van die muisbeenmurg (BMDM's) te infekteer met R179 wat gegroei was in die teenwoordigheid en afwesigheid van Tween-80 en die effek op die makrofagetranskriptoom deur hoë deurset (RNA-Seq) te analiseer. Die transkriptome profiel vir die BMDM's was anders tussen infeksie met R179, gekweek met en sonder Tween-80. Terwyl 'n algemene afregulering van gene waargeneem is vir infeksie met mikobakterieë wat in Tween-80 gegroei het, het die wasmiddelvrye gekweekte Mtb 'n grootliks opregulering van gene veroorsaak, sowel as 'n sterk pro-inflammatoriese reaksie. Dit het getoon dat dit belangrik is om die gebruik van skoonmaakmiddels by die kweek van mykobakterieë wat vir infeksiestudies gebruik gaan word, uit te sluit. Die huidige projek was daarop gemik om differensieel uitgedrukte gene in gasheerselle te identifiseer tussen infeksie met patogeniese (Mtb H37Rv en Beijing kliniese isolaat R179) en niepatogeniese (M. smegmatis en M. bovis BCG) mykobakterieë. Die virulensievlak verskil tussen hierdie spesies. Om vas te stel of virulensie 'n invloed op die makrofage-reaksie kan hê, is BMDM's geinfekteer met Beijing Mtb kliniese isolate R5527 (hiper-virulent) of R1507 (hipo-virulent). Die makrofage-reaksie is vergelyk deur middel van transkriptomiese profiele en het verskille getoon vir infeksie tussen hipo- en hiper-virulente Mtb. Prominente verskille is geopenbaar in die sitokienen chemokienvlakke wat veroorsaak word tussen die hipo- en hipervirulente Mtb, insluitend proinflammatoriese sitokiene IL-1β, IL-6, IL-12β en die chemokien RANTES (CCL5). Daar sou dus verwag kon word dat differensiaal uitgedrukte gasheergene gevind word in die vergelyking tussen die vier mykobakteriese spesies. Die benadering om molekules te identifiseer wat moontlik betrokke is by die intrasellulêre oorlewing van mykobakterieë, was om die makrofage-reaksie op infeksie tussen nie-patogeniese mykobakterieë (M. smegmatis en M. bovis BCG) wat normaalweg binne makrofage gedood word te vergelyk met patogeniese mykobakterieë (Mtb H37Rv en Beijing kliniese isolaat R179) wat normaalweg binne makrofage oorleef. Die doel was om makrofage-molekules te identifiseer wat differensieel tot uitdrukking kom tussen infeksie met patogeniese en nie-patogeniese mykobakterieë. Makrofage afkomstig van muisbeenmurg is geinfekteer met mykobakterieë wat in die afwesigheid van skoonmaakmiddel gekweek is. RNA-Seq is gebruik om die ekspressievlakke van gene te bepaal deur mRNA-transkripsies te meet. Die fokus is geplaas op gene wat differensieel tot uiting kom wanneer makrofage geïnfekteer is met patogeniese mykobakterieë en met 'n meervoudsverandering van 2 of meer. Hierdie gene is op die kortlys geplaas en gevalideer deur middel van qPCR. Padanalise (met behulp van STRING) het aan die lig gebring dat gene met 'n antivirale funksie en veroorsaak deur interferon -sein sterk onder die differensieel uitgedrukte gene verskyn. Hierdie lys bevat Mx -gene van muise wat nie vir funksionele proteïene kodeer nie. Dit het daartoe gelei dat die studie oorgegaan het na 'n model van 'n menslike makrofage-sel om die geselekteerde gene te toets vir hul potensiële rol in die intrasellulêre oorlewing van mykobakterieë. Geselekteerde gene sluit in MX1, MX2, IFITM1, IFITM3, OAS1, OAS2 en OAS3. BCG-infeksie kan saamgegroepeer word met die reaksie onder infeksie met die patogeniese stamme en is daarom gebruik as 'n aanduiding vir infeksie met die patogeniese spesies. Gene-uitdrukkingsvlakke is verlaag of verlaag deur die gebruik van onderskeidelik siRNA of nie-virale vektore om te toets of enige van die gene van belang 'n rol speel in die intrasellulêre oorlewing van mykobakterieë. Deur MX2 in M. smegmatis-geïnfekteerde THP-1-makrofage af te slaan, het verhoogde intrasellulêre bakteriegroei veroorsaak. Die onderdrukking van IFITM1 en IFITM3 in M. smegmatisgeïnfekteerde makrofage het dieselfde neiging tot verhoogde intrasellulêre groei tot gevolg gehad. Dieselfde tipe waarneming is gemaak in 'n verwante gepubliseerde studie oor die afbreek van OAS -gene waarvoor die gevolgtrekking gekom het dat hierdie differensieel uitgedrukte gene met 'n antivirale rol ook 'n beskermende rol speel tydens mikobakteriese infeksies. In teenstelling hiermee het die uitdrukking van MX1 en OAS3 in BCG-geïnfekteerde makrofage 'n aansienlike vermindering in die aantal intrasellulêre mykobakterieë veroorsaak. Die gelyktydige behandeling van BCG-geïnfekteerde makrofage met MX1- en OAS3-vektore het gelei tot 'n baie beduidende afname in CFU 48 uur na infeksie in vergelyking met die onbehandelde kontrole. Hierdie resultaat is dus in ooreenstemming met voorheen gepubliseerde gene wat 'n antivirale rol in gasheerselle speel en ook beskerm teen mikobakterieë. MX1 en OAS3 kan belowende kandidate wees as dit ondersoek word as teikens in gasheergerigte terapieë teen tuberkulose.
Description
Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2021.