Recombinant Saccharomyces cerevisiae strains for improved bioethanol production from starch-based substrates
Date
2020-03
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Increased concern regarding climate change has highlighted the need for alternative sources of
energy and fuel. The production of bioethanol from starch is a mature technology and is in the
favourable position to replace fossil fuels, particularly in the transport sector. However, certain
bottlenecks associated with the starch-to-ethanol process increase the cost and have made it
difficult for bioethanol to compete with fossil fuel prices. Major bottlenecks include the high
cost of the substrate, the need for expensive exogenous enzyme cocktails and the energy
requirements for heating and temperature regulation.
These bottlenecks could be addressed through the use of cheaper starch-based substrates and the
development of yeast strains for a single-step hydrolysis-and-fermentation approach called
consolidated bioprocessing (CBP). CBP requires recombinant yeast strains to produce amylases that
hydrolyse raw starch while simultaneously converting the sugar products to high ethanol titres. A
number of amylolytic strains have been developed, but continued research strives to increase the
levels of amylase production. One approach is to use stronger promoters since they are the main
regulators of gene expression and essential for effective heterologous expression in yeast. In
addition, advances in molecular techniques have made promoter engineering a viable approach to
further increase the expression of heterologous genes.
Two industrial amylolytic yeast strains, ER T12 and M2n T1, expressing both the Talaromyces
emersonii α-amylase and glucoamylase genes, were evaluated for their ability to hydrolyse starch in
untreated broken rice and ferment the sugars to ethanol. Cell-free hydrolysis trials showed that
crude enzymes from the ER T12 strain hydrolysed broken rice with a similar saccharification yield
as a commercial amylase cocktail. Both strains were able to convert starch to ethanol in a single
step, reaching theoretical maximum ethanol titers (roughly 100 g/l) and converting 100% of the
estimated available carbon to products. Complete replacement of exogenous enzyme addition was
achieved with the ER T12 strain without reducing ethanol productivity or yield. The ER T12 strain
therefore has full CBP capability on broken rice and is a particularly good contender for
application in commercial ethanol plants.
It is known that the most effective promoter-gene combination is required for optimal heterologous
gene expression. Eight endogenous Saccharomyces cerevisiae promoters were investigated for
expression of the Aspergillus terreus α-amylase gene in the S. cerevisiae Y294 laboratory strain.
The RPS25AP, HXT7P, TPI1P and TEF1P promoters showed higher expression levels than the ENO1P
benchmark promoter. In an effort to further increase amylase expression,
six promoters were engineered to contain the S. cerevisiae RPS25Ai intron. The inclusion of
the intron resulted in an overall increase in amylase activity, protein production and transcript
levels. The top-performing Y294[DC-TEF] and Y294[DC-TDHi] strains delivered high ethanol titres
(94% and 97% of the theoretical maximum, respectively) and outperformed the benchmark strain on raw
corn starch and broken rice.
This study showed that industrial amylolytic yeasts could be employed for the production of
bioethanol from untreated broken rice. However, there is also scope to further improve existing
amylolytic strains by selecting and engineering strong promoters for heterologous gene
expression.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Toenemende kommer rakende klimaatsverandering beklemtoon die noodsaaklikheid vir alternatiewe energie- en brandstofbronne. Die produksie van bio-etanol vanaf stysel is ‘n gevestigde tegnologie en in ‘n goeie posisie om fossielbrandstof te vervang, veral in die vervoersektor. Sekere bottelnekke relevant tot die stysel-tot-etanol proses verhoog egter die insetkoste en maak dit moeilik vir bio-etanol om met fossielbrandstof pryse te kompeteer. Die vernaamste bottelnekke sluit die hoë prys van die substraat, die noodsaaklike byvoeging van duur ensiemformulerings en die energievereistes vir verhitting en temperatuur-regulering in. Hierdie bottelnekke kan aangespreek word deur die evaluering van goedkoper alternatiewe styselagtige substrate en die ontwikkeling van gisrasse vir ‘n enkelstap hidroliese-en-fermentasie-benadering bekend as gekonsolideerde bioprosessering (GBP). GBP vereis dat rekombinante gisrasse amilases produseer wat rou stysel afbreek en terselfdertyd die suikerprodukte na hoë etanolkonsentrasies omskakel. ‘n Aantal amilolitiese gisrasse is reeds ontwikkel, maar voortdurende navorsing streef daarna om hoër vlakke van amilase te produseer. Een benadering is om sterker promotors te gebruik aangesien hulle die hoofreguleerders van geenuitdrukking en essensieël vir effektiewe heteroloë geenuitdrukking in gis is. Verder het die vooruitgang in molekulêre tegnieke die manipulering van promotors om geenuitdrukking verder te verhoog, ‘n lewensvatbare benadering gemaak. Twee industriële amilolitiese gisrasse, ER T12 en M2n T1, wat beide die α-amilase en glukoamilase vanaf Talaromyces emersonii uitdruk, was geëvalueer vir hul vermoë om stysel in onbehandelde gebreekte rys af te breek en die suikers na etanol te fermenteer. Selvrye hidroliese-eksperimente het gewys dat kru ensieme vanaf die ER T12 ras gebreekte rys kon afbreek met dieselfde versuikeringsopbrengs as ‘n kommersiële amilase-formulering. Altwee rasse kon stysel na etanol in ‘n enkele stap omskakel, het die teoretiese maksimum etanolkonsentrasie (ongeveer 100 g/l) bereik en het 100% van die beskikbare koolstof na produkte omgeskakel. Die ER T12 ras het die byvoeging van ensieme uitgeskakel sonder om die etanolproduktiwiteit of -opbrengs te verlaag. Die ER T12 ras het dus volledige GBP vermoë en is ‘n aanspraakmaker vir toepassing in kommersiële etanol-aanlegte. Dit is bekend dat die mees effektiewe promotor-geenkombinasie vir optimale geenuitdrukking vereis word. Agt endogene Saccharomyces cerevisiae promotors is vir die uitdrukking van die Aspergillus terreus α-amilase geen in die S. cerevisiae Y294 laboratoriumras ondersoek. Die RPS25AP, HXT7P, TPI1P en TEF1P promotors het hoër uitdrukkingsvlakke as die ENO1P verwysingspromoter getoon. In ‘n poging om uitdrukking van die amilase verder te verhoog, is ses promotors aangepas om die S. cerevisiae RPS25Ai intron te bevat. Die insluiting van die intron het tot ‘n algemene verhoging in amilase-aktiwiteit, proteinproduksie en transkripsievlakke gelei. Die beste Y294[DC-TEF] enY294[DC-TDHi] rasse het hoë etanolkonsentrasies gelewer (94% en 97% van die teoretiese maksimum onderskeidelik) en het die verwysingsras op rou mieliestysel en gebreekte rys oortref. Hierdie studie het getoon dat industriële amilolitiese gisrasse vir die produksie van bio-etanol vanaf gebreekte rys as alternatiewe substraat gebruik kan word. Daar is egter ook ruimte om bestaande amilolitiese rasse verder te verbeter deur die seleksie en modifisering van sterk promotors vir heteroloë geenuitdrukking.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Toenemende kommer rakende klimaatsverandering beklemtoon die noodsaaklikheid vir alternatiewe energie- en brandstofbronne. Die produksie van bio-etanol vanaf stysel is ‘n gevestigde tegnologie en in ‘n goeie posisie om fossielbrandstof te vervang, veral in die vervoersektor. Sekere bottelnekke relevant tot die stysel-tot-etanol proses verhoog egter die insetkoste en maak dit moeilik vir bio-etanol om met fossielbrandstof pryse te kompeteer. Die vernaamste bottelnekke sluit die hoë prys van die substraat, die noodsaaklike byvoeging van duur ensiemformulerings en die energievereistes vir verhitting en temperatuur-regulering in. Hierdie bottelnekke kan aangespreek word deur die evaluering van goedkoper alternatiewe styselagtige substrate en die ontwikkeling van gisrasse vir ‘n enkelstap hidroliese-en-fermentasie-benadering bekend as gekonsolideerde bioprosessering (GBP). GBP vereis dat rekombinante gisrasse amilases produseer wat rou stysel afbreek en terselfdertyd die suikerprodukte na hoë etanolkonsentrasies omskakel. ‘n Aantal amilolitiese gisrasse is reeds ontwikkel, maar voortdurende navorsing streef daarna om hoër vlakke van amilase te produseer. Een benadering is om sterker promotors te gebruik aangesien hulle die hoofreguleerders van geenuitdrukking en essensieël vir effektiewe heteroloë geenuitdrukking in gis is. Verder het die vooruitgang in molekulêre tegnieke die manipulering van promotors om geenuitdrukking verder te verhoog, ‘n lewensvatbare benadering gemaak. Twee industriële amilolitiese gisrasse, ER T12 en M2n T1, wat beide die α-amilase en glukoamilase vanaf Talaromyces emersonii uitdruk, was geëvalueer vir hul vermoë om stysel in onbehandelde gebreekte rys af te breek en die suikers na etanol te fermenteer. Selvrye hidroliese-eksperimente het gewys dat kru ensieme vanaf die ER T12 ras gebreekte rys kon afbreek met dieselfde versuikeringsopbrengs as ‘n kommersiële amilase-formulering. Altwee rasse kon stysel na etanol in ‘n enkele stap omskakel, het die teoretiese maksimum etanolkonsentrasie (ongeveer 100 g/l) bereik en het 100% van die beskikbare koolstof na produkte omgeskakel. Die ER T12 ras het die byvoeging van ensieme uitgeskakel sonder om die etanolproduktiwiteit of -opbrengs te verlaag. Die ER T12 ras het dus volledige GBP vermoë en is ‘n aanspraakmaker vir toepassing in kommersiële etanol-aanlegte. Dit is bekend dat die mees effektiewe promotor-geenkombinasie vir optimale geenuitdrukking vereis word. Agt endogene Saccharomyces cerevisiae promotors is vir die uitdrukking van die Aspergillus terreus α-amilase geen in die S. cerevisiae Y294 laboratoriumras ondersoek. Die RPS25AP, HXT7P, TPI1P en TEF1P promotors het hoër uitdrukkingsvlakke as die ENO1P verwysingspromoter getoon. In ‘n poging om uitdrukking van die amilase verder te verhoog, is ses promotors aangepas om die S. cerevisiae RPS25Ai intron te bevat. Die insluiting van die intron het tot ‘n algemene verhoging in amilase-aktiwiteit, proteinproduksie en transkripsievlakke gelei. Die beste Y294[DC-TEF] enY294[DC-TDHi] rasse het hoë etanolkonsentrasies gelewer (94% en 97% van die teoretiese maksimum onderskeidelik) en het die verwysingsras op rou mieliestysel en gebreekte rys oortref. Hierdie studie het getoon dat industriële amilolitiese gisrasse vir die produksie van bio-etanol vanaf gebreekte rys as alternatiewe substraat gebruik kan word. Daar is egter ook ruimte om bestaande amilolitiese rasse verder te verbeter deur die seleksie en modifisering van sterk promotors vir heteroloë geenuitdrukking.
Description
Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2020.