Investigating the impact of MpAPr1, an aspartic protease from the yeast Metschnikowia pulcherrima, on wine properties
Date
2017-03
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Protein removal is a key step during the production of white wine in order to avoid the possible appearance of a harmless but unsightly haze. Alternatives to the use of bentonite are actively
sought because of technological, organoleptic and sustainable issues associated with its use.
Acid proteases that are able to break down proteins under winemaking conditions could be one
such alternative. Recent literature reports the successful outcome of the addition of fungal
aspartic proteases from Aspergillus and Botrytis. In this study, MpAPr1, an extracellular aspartic
protease previously isolated and partially characterised from the yeast Metschnikowia
pulcherrima, was cloned and expressed heterologously in Komagataella pastoris. Enzymatic
properties of MpAPr1 were initially (Km, Vmax, K’i, optimal pH and temperature for protease
activity, impact of minerals, sugars and ethanol on protease activity) characterised in a crude
extract. After several attempts using different techniques, MpAPr1 was successfully purified via
cation exchange chromatography. Its activity against haze-forming grape proteins was initially
tested in a model solution under optimal environmental conditions (for MpAPr1 activity) and
under those occurring during winemaking (pH 3.5 and 25°C). Thereafter, MpAPr1 activity was
evaluated in grape must and throughout alcoholic fermentation. These experiments showed that
MpAPr1 was able to degrade certain haze-forming proteins, especially chitinases, under optimal
conditions and to a lesser extent under winemaking conditions. Prior denaturation of the target
proteins by heat treatment was also not required. Moreover, MpAPr1 was able to degrade yeast
proteins in a model solution under both conditions. Finally, the presence of MpAPr1,
supplemented to grape must, resulted in the partial degradation of grape proteins throughout
fermentation and ultimately in a slight difference in the wine’s volatile compound composition.
Winemaking conditions limited its impact and it is thus proposed that future work focus on
enhancing MpAPr1 activity to make it a viable alternative to bentonite. The study nevertheless
provides further evidence that aspartic proteases could represent a potential alternative to
bentonite for the wine industry and that non-Saccharomyces yeasts such as M. pulcherrima
could have a beneficial impact on wine properties.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Proteïen verwydering is 'n belangrike stap tydens die vervaardiging van witwyn en vermy die voorkoms van 'n onooglike maar skadelose wasigheid. Alternatiewe vir die gebruik van bentoniet is aktief begeerd as gevolg van tegnologiese, organoleptiese en volhoubare kwessies wat verband hou met die gebruik daarvan. Suur proteases wat die afbraak van proteïene kan fasiliteer onder wynmaak toestande kan dus as sulke alternatiewe dien. Onlangse literatuur beskryf die suksesvolle gebruik van swam-afkomstige aspartiensuur proteases vanaf Aspergillus en Botrytis. In hierdie studie was MpAPr1, ‘n ekstrasellulêre aspertiensuur protease voorheen geïsoleer en gedeeltelik gekenmerk vanaf die gis Metschnikowia pulcherrima, gekloneer en uitgedruk in Komagataella pastoris. Ensiem kenmerke (Km, Vmax, K’i, optimale pH and temperature vir protease aktiwiteit, impak van minerale, suiker en etanol) was aanvanklik bepaal vanaf ‘n ru-ekstrak. Na verskeie pogings deur gebruik te maak van verskeie tegnieke, is MpAPr1 suksesvol gesuiwer via katioonuitruilings chromatografie. Ensiem aktiwiteit teen waas-vormende druif proteïene was aanvanklik getoets in ‘n model oplossing onder optimale omgewings toestande (vir MpAPr1 aktiwiteit) en dié wat gedurende wynmaak voorkom (pH 3.5 en 25 °C). Daarna was MpAPr1 aktiwiteit geëvalueer in druiwemos tydens alkoholiese fermentasie. Eksperimente het getoon dat MpAPr1 verskeie waas-vormende proteïene, veral chitinases, afbreek onder optimale omstandighede en in 'n mindere mate onder wynmaak toestande. Voorafgaande denaturasie van die teiken proteïene deur hitte behandeling was nie benodig nie. Verdermeer was MpAPr1 instaat om gis proteïene af te breek in 'n model oplossing onder beide toestande. Ten slotte, die teenwoordigheid van MpAPr1 in druiwesap het gelei tot die gedeeltelike afbraak van proteïene tydens fermentasie asook tot 'n effense verskil in die uiteindelike vlugtige verbinding samestelling. Wynmaak toestande het gelei to beperkte ensiem impak en dus word dit voorgestel dat toekomstige werk fokus op die verbetering van MpAPr1 aktiwiteit sodat dit as 'n lewensvatbare alternatief vir bentoniet behandeling kan dien. Hierdie studie stel nogtans bewyse voor dat aspartiensuur proteases ‘n moontlike alternatief vir bentoniet kan wees in die wynbedryf en dat nie-Saccharomyces giste soos M. pulcherrima voordelige impakte op wyn einskappe kan hê.
FRENCH RESUME: L’élimination des protéines est une étape-clef durant la production du vin blanc afin d’éviter l’apparition d’un voile inoffensif mais disgracieux, causé par la dénaturation de ces protéines (un phénomène connu sous le nom de “casse protéique”) au cours du vieillissement ou du stockage de ces vins en conditions sous-optimales. Des alternatives à l’utilisation de la bentonite, une argile couramment employée pour ses propriétés adsorbantes, sont activement recherchées pour des raisons technologiques, organoleptiques et durables associées à son utilisation. Les protéases acides capables de dégrader les protéines en conditions de vinification pourraient constituer une telle alternative. La littérature récente rapporte les succès obtenus lors de l’addition de protéases aspartiques d’origine fongique isolées d’Aspergillus et de Botrytis. Dans cette étude, MpAPr1, une protéase aspartique extracellulaire de la levure Metschnikowia pulcherrima, précédemment isolée et partiellement caractérisée, a été clonée et exprimée de manière hétérologue chez la levure Komagataella pastoris. Les propriétés enzymatiques de MpAPr1 (Km, Vmax, K’i, pH et température optimaux d’activité, impact de minéraux, sucres et éthanol sur l’activité enzymatique) ont été initialement caractérisées sur un extrait brut. Après de nombreux essais utilisant diverses techniques, elle a été purifiée avec succès par chromatographie échangeuse de cations. Son activité contre les protéines de raisin responsables de casse protéique a été tout d’abord évaluée en solution modèle en conditions environnementales optimales pour son activité et en conditions telles que celles trouvées lors de la vinification (pH 3.5 et 25°C). Par la suite, l’activité de MpAPr1 a été évaluée dans du moût de raisin et au cours de la fermentation alcoolique. Ces expérimentations ont montré que MpAPr1 est capable de dégrader certaines protéines responsables de casse, particulièrement les chitinases, en conditions optimales, mais aussi, bien que de manière moindre, en conditions de vinification. La dénaturation préalable des protéines-cibles par traitement à la chaleur n’a pas été pas requis. De plus, MpAPr1 est capable de dégrader les protéines de levure en solution modèle dans les deux conditions. Enfin, la présence de MpAPr1, supplémentée dans du moût de raisin, a résulté en la dégradation partielle des protéines du raisin au cours de la fermentation et à la fin, en une légère différence dans la composition en composés volatils du vin. Les conditions oenologiques ont limité son impact et il est donc proposé que de futurs travaux se concentrent sur l’amélioration de l’activité de MpAPr1 afin d’en faire une alternative viable à la bentonite. L’étude a toutefois renforcé l’idée que les protéases aspartiques pourraient représenter une alternative potentielle à la bentonite pour l’industrie viti-vinicole et que les levures non-Saccharomyces telles que M. pulcherrima pourraient impacter positivement sur les propriétés technologiques du vin.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Proteïen verwydering is 'n belangrike stap tydens die vervaardiging van witwyn en vermy die voorkoms van 'n onooglike maar skadelose wasigheid. Alternatiewe vir die gebruik van bentoniet is aktief begeerd as gevolg van tegnologiese, organoleptiese en volhoubare kwessies wat verband hou met die gebruik daarvan. Suur proteases wat die afbraak van proteïene kan fasiliteer onder wynmaak toestande kan dus as sulke alternatiewe dien. Onlangse literatuur beskryf die suksesvolle gebruik van swam-afkomstige aspartiensuur proteases vanaf Aspergillus en Botrytis. In hierdie studie was MpAPr1, ‘n ekstrasellulêre aspertiensuur protease voorheen geïsoleer en gedeeltelik gekenmerk vanaf die gis Metschnikowia pulcherrima, gekloneer en uitgedruk in Komagataella pastoris. Ensiem kenmerke (Km, Vmax, K’i, optimale pH and temperature vir protease aktiwiteit, impak van minerale, suiker en etanol) was aanvanklik bepaal vanaf ‘n ru-ekstrak. Na verskeie pogings deur gebruik te maak van verskeie tegnieke, is MpAPr1 suksesvol gesuiwer via katioonuitruilings chromatografie. Ensiem aktiwiteit teen waas-vormende druif proteïene was aanvanklik getoets in ‘n model oplossing onder optimale omgewings toestande (vir MpAPr1 aktiwiteit) en dié wat gedurende wynmaak voorkom (pH 3.5 en 25 °C). Daarna was MpAPr1 aktiwiteit geëvalueer in druiwemos tydens alkoholiese fermentasie. Eksperimente het getoon dat MpAPr1 verskeie waas-vormende proteïene, veral chitinases, afbreek onder optimale omstandighede en in 'n mindere mate onder wynmaak toestande. Voorafgaande denaturasie van die teiken proteïene deur hitte behandeling was nie benodig nie. Verdermeer was MpAPr1 instaat om gis proteïene af te breek in 'n model oplossing onder beide toestande. Ten slotte, die teenwoordigheid van MpAPr1 in druiwesap het gelei tot die gedeeltelike afbraak van proteïene tydens fermentasie asook tot 'n effense verskil in die uiteindelike vlugtige verbinding samestelling. Wynmaak toestande het gelei to beperkte ensiem impak en dus word dit voorgestel dat toekomstige werk fokus op die verbetering van MpAPr1 aktiwiteit sodat dit as 'n lewensvatbare alternatief vir bentoniet behandeling kan dien. Hierdie studie stel nogtans bewyse voor dat aspartiensuur proteases ‘n moontlike alternatief vir bentoniet kan wees in die wynbedryf en dat nie-Saccharomyces giste soos M. pulcherrima voordelige impakte op wyn einskappe kan hê.
FRENCH RESUME: L’élimination des protéines est une étape-clef durant la production du vin blanc afin d’éviter l’apparition d’un voile inoffensif mais disgracieux, causé par la dénaturation de ces protéines (un phénomène connu sous le nom de “casse protéique”) au cours du vieillissement ou du stockage de ces vins en conditions sous-optimales. Des alternatives à l’utilisation de la bentonite, une argile couramment employée pour ses propriétés adsorbantes, sont activement recherchées pour des raisons technologiques, organoleptiques et durables associées à son utilisation. Les protéases acides capables de dégrader les protéines en conditions de vinification pourraient constituer une telle alternative. La littérature récente rapporte les succès obtenus lors de l’addition de protéases aspartiques d’origine fongique isolées d’Aspergillus et de Botrytis. Dans cette étude, MpAPr1, une protéase aspartique extracellulaire de la levure Metschnikowia pulcherrima, précédemment isolée et partiellement caractérisée, a été clonée et exprimée de manière hétérologue chez la levure Komagataella pastoris. Les propriétés enzymatiques de MpAPr1 (Km, Vmax, K’i, pH et température optimaux d’activité, impact de minéraux, sucres et éthanol sur l’activité enzymatique) ont été initialement caractérisées sur un extrait brut. Après de nombreux essais utilisant diverses techniques, elle a été purifiée avec succès par chromatographie échangeuse de cations. Son activité contre les protéines de raisin responsables de casse protéique a été tout d’abord évaluée en solution modèle en conditions environnementales optimales pour son activité et en conditions telles que celles trouvées lors de la vinification (pH 3.5 et 25°C). Par la suite, l’activité de MpAPr1 a été évaluée dans du moût de raisin et au cours de la fermentation alcoolique. Ces expérimentations ont montré que MpAPr1 est capable de dégrader certaines protéines responsables de casse, particulièrement les chitinases, en conditions optimales, mais aussi, bien que de manière moindre, en conditions de vinification. La dénaturation préalable des protéines-cibles par traitement à la chaleur n’a pas été pas requis. De plus, MpAPr1 est capable de dégrader les protéines de levure en solution modèle dans les deux conditions. Enfin, la présence de MpAPr1, supplémentée dans du moût de raisin, a résulté en la dégradation partielle des protéines du raisin au cours de la fermentation et à la fin, en une légère différence dans la composition en composés volatils du vin. Les conditions oenologiques ont limité son impact et il est donc proposé que de futurs travaux se concentrent sur l’amélioration de l’activité de MpAPr1 afin d’en faire une alternative viable à la bentonite. L’étude a toutefois renforcé l’idée que les protéases aspartiques pourraient représenter une alternative potentielle à la bentonite pour l’industrie viti-vinicole et que les levures non-Saccharomyces telles que M. pulcherrima pourraient impacter positivement sur les propriétés technologiques du vin.
Description
Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2017.
Keywords
Metschnikowia pulcherrima, Acid proteases, Aspartic protease (MpAPr1), Wine and wine making, Wine -- Protein content, UCTD