Characterizing mycobacterium tuberculosis persister populations.
Date
2021-09
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: The adaptation of Mycobacterium tuberculosis in the host contributes to tuberculosis (TB) being one of the leading pulmonary infectious diseases in the world. As infection with M. tuberculosis progresses, the bacilli experience various degrees of host stressors in the macrophage phagosome such as low pH, nutrient deprivation or exposure to toxic agents, which promotes cell-to-cell phenotypic variation. This contributes to the establishment of varying physiological states that may differentially drive disease progression. This includes a physiologically viable but non- or slowly replicating persister subpopulation, which was of interest in this study. Persisters remain metabolically active, and are characterized as multi-drug tolerant, despite the population being genetically susceptible to antibiotics. Persisters additionally evade the host immune response and macrophage antimicrobial processes by adapting their metabolic pathways to maintain survival and persistence in the host. Understanding of how host exposure promotes formation and survival of persisters is limited. Improved knowledge on the physiological state of M. tuberculosis persisters, including factors contributing to a persistent state is required to understand M. tuberculosis adaptation and survival in the host, in particular in the macrophage niche. In this study we applied a novel flow cytometry-based, culture-independent technique, termed fluorescence dilution (FD), to characterize the single-cell replication dynamics of M. tuberculosis following macrophage infection. Various fluorescent probes were tested in this study, highlighting specific challenges for application in M. tuberculosis. FD in combination with flourescent staining using a metabolic esterase reactive probe, calcein violet AM (CV-AM), provided an effective approach to investigate the physiological state of M. tuberculosis following macrophage infection. We assessed whether varying bacterial infection and intracellular burdens influence persister numbers inside macrophages. Phagocytosis and phagosome acidification was additionally inhibited using Cytochalasin D and Bafilomycin A1, respectively, to determine whether these host antimicrobial processes impact persister numbers. Limited or no replication contributes to the difficulty in identifying and recovering persisters as these bacteria are not accurately quantified by colony forming unit (CFU) plating. Developing a rapid flow cytometric method to enumerate and assess viability of M. smegmatis and M. tuberculosis in vitro and macrophage infection models has the potential to contribute to TB control programs. Conventional CFU counting methods are time consuming and hindered by the lengthy turn-around time (3-6 weeks), whereas flow cytometry sample acquisition, analyses and enumeration of M. tuberculosis could be attained within a few hours. Accurate counts were obtained from flow cytometric reference beads, eliminating the need for bacterial culturing.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Mycobacterium tuberculosis se vermoë om in die gasheer omgewing aan te pas dra daartoe by dat tuberkulose (TB) een van die vernaamste pulmonêre siektes in die wêreld is. Soos die infeksie binne die gasheer vorder ervaar die bakterieë verskeie stres-induserende seine vanaf die makrofaag fagosoom soos ‘n lae pH, nutrient berowing of blootstelling aan toksiese agente wat sel-tot-sel fenotipiese variasie bevorder. Dit dra by tot die bevestiging van verskeie fisiologiese toestande wat die siekte verskillend laat voortgaan. Dit sluit in die fisiologiese vatbare maar geen- of stadig repliserende persister sub-populasies wat verwant hou met dié studie. Persisters bly metabolies aktief en word uitgeken as antibiotika verdraagbaar alhoewel die populasie geneties vatbaar is. Persisters kan ook die gasheer immuun response en die makrofaag se antimikrobiese prosesse vermei deur hul metaboliese paaie aan te pas om te oorleef en te volhard in die gasheer. Die verstandhouding oor hoe blootstelling aan die gasheer persister vormasie en oorlewing bevorder is beperk. Verbeterde kennis oor die fisiologiese stand van M. tuberculosis persisters, insluitend faktore wat by dra tot persister vormasie is nodig om die aanpassing en oorlewing van M. tuberculosis in die gasheer veral in die makrofaag omgewing beter te verstaan. In die studie het ons a nuwe vloei sitometriese gebasseerde, kultuur-onafhanklike tegniek, genaamd fluoresensie verduninng (FD) toegepas om die enkelsel replikasie dinamika van M. tuberculosis te beskryf na makrofaag infeksies. Verskeie fluoresensie peile was getoets en spesifieke struikelblokke is in M. tuberculosis geïdentifiseer wat die toepassing van die tegniek bemoeilik. FD in kombinasie met fluoresensie verkleuring deur gebruik te maak van ‘n metaboliese esterase reaktiewe peil, calcein violet AM (CV-AM), het ‘n effektiewe manier geskep om die fisiologiese stand van M. tuberculosis te bestudeer na makrofaag infeksies. Ons het gekyk of wisselende bakteriële infeksies en intrasellulêre ladings persister getalle binne die makrofaag beïnvloed. Fagositose en fagosoom versuring was verhinder deur onderskeidelik gebruik te maak van Cytochalasin D en Bafilomycin A1 om te bepaal of dié antimikrobiese prosesse ‘n impak het op persister getalle. Geen of beperkte replikasie dra by tot die moeilikheid om persisters te identifiseer en te isoleer aangesien dié populasie nie akkuraat deur kolonie vormende eenheid (CFU) uitplating gekwantifiseer kan word nie. Om ‘n vinnige vloei sitometriese metode te ontwikkel wat M. smegmatis en M. tuberculosis in vitro en in makrofaag infeksie modelle assesseer en tel het die vermoë om by te dra tot TB kontrole programme. Konvensionele CFU uitplating is tydrowend en word bemoeilik deur die lang wag periode (3-6 weke). In die geval van vloei sitometrie kan die M. tuberculosis monsters verkry, geanaliseer en getel word binne enkele ure. Akkurate tellings was verkry deur vloei sitometriese verwysings balletjies dus word die behoefte om bakterieë te kweek verwyder. Vloei sitometrie in kombinasie met FD en fluoresensie verkleuring het ‘n effektiewe benadering geskep om M. tuberculosis persisters op te tel en te tipeer. Persister getalle was nie geaffekteer deur die infeksie lading nie, maar het ‘n sterk korrelasie gehad met die intrasellulêre bakteriële ladings binne die makrofaag. ‘n Verandering in die metaboliese esterase aktiwiteit van persisters was deurlopend waargeneem. Laastens het die verhindering van fagositose persister getalle vermeerder terwyl fagosoom versuring geen effek gehad het nie. Die heterogenesiteit in die fisiologiese stand van M. tuberculosis beklemtoon hoe belangrik dit is om die aanpassings strategieë wat deur M. tuberculosis gebruik word om persisters te bevorder te verstaan. Die resultate en nuwe tegnieke verkry deur die bogenoemde studie kan bydra tot toekomstige navorsing oor die metaboliese eienskappe van M. tuberculosis en dus die ontwerp van antibiotika wat spesifiek persisters teiken, aanhelp.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Mycobacterium tuberculosis se vermoë om in die gasheer omgewing aan te pas dra daartoe by dat tuberkulose (TB) een van die vernaamste pulmonêre siektes in die wêreld is. Soos die infeksie binne die gasheer vorder ervaar die bakterieë verskeie stres-induserende seine vanaf die makrofaag fagosoom soos ‘n lae pH, nutrient berowing of blootstelling aan toksiese agente wat sel-tot-sel fenotipiese variasie bevorder. Dit dra by tot die bevestiging van verskeie fisiologiese toestande wat die siekte verskillend laat voortgaan. Dit sluit in die fisiologiese vatbare maar geen- of stadig repliserende persister sub-populasies wat verwant hou met dié studie. Persisters bly metabolies aktief en word uitgeken as antibiotika verdraagbaar alhoewel die populasie geneties vatbaar is. Persisters kan ook die gasheer immuun response en die makrofaag se antimikrobiese prosesse vermei deur hul metaboliese paaie aan te pas om te oorleef en te volhard in die gasheer. Die verstandhouding oor hoe blootstelling aan die gasheer persister vormasie en oorlewing bevorder is beperk. Verbeterde kennis oor die fisiologiese stand van M. tuberculosis persisters, insluitend faktore wat by dra tot persister vormasie is nodig om die aanpassing en oorlewing van M. tuberculosis in die gasheer veral in die makrofaag omgewing beter te verstaan. In die studie het ons a nuwe vloei sitometriese gebasseerde, kultuur-onafhanklike tegniek, genaamd fluoresensie verduninng (FD) toegepas om die enkelsel replikasie dinamika van M. tuberculosis te beskryf na makrofaag infeksies. Verskeie fluoresensie peile was getoets en spesifieke struikelblokke is in M. tuberculosis geïdentifiseer wat die toepassing van die tegniek bemoeilik. FD in kombinasie met fluoresensie verkleuring deur gebruik te maak van ‘n metaboliese esterase reaktiewe peil, calcein violet AM (CV-AM), het ‘n effektiewe manier geskep om die fisiologiese stand van M. tuberculosis te bestudeer na makrofaag infeksies. Ons het gekyk of wisselende bakteriële infeksies en intrasellulêre ladings persister getalle binne die makrofaag beïnvloed. Fagositose en fagosoom versuring was verhinder deur onderskeidelik gebruik te maak van Cytochalasin D en Bafilomycin A1 om te bepaal of dié antimikrobiese prosesse ‘n impak het op persister getalle. Geen of beperkte replikasie dra by tot die moeilikheid om persisters te identifiseer en te isoleer aangesien dié populasie nie akkuraat deur kolonie vormende eenheid (CFU) uitplating gekwantifiseer kan word nie. Om ‘n vinnige vloei sitometriese metode te ontwikkel wat M. smegmatis en M. tuberculosis in vitro en in makrofaag infeksie modelle assesseer en tel het die vermoë om by te dra tot TB kontrole programme. Konvensionele CFU uitplating is tydrowend en word bemoeilik deur die lang wag periode (3-6 weke). In die geval van vloei sitometrie kan die M. tuberculosis monsters verkry, geanaliseer en getel word binne enkele ure. Akkurate tellings was verkry deur vloei sitometriese verwysings balletjies dus word die behoefte om bakterieë te kweek verwyder. Vloei sitometrie in kombinasie met FD en fluoresensie verkleuring het ‘n effektiewe benadering geskep om M. tuberculosis persisters op te tel en te tipeer. Persister getalle was nie geaffekteer deur die infeksie lading nie, maar het ‘n sterk korrelasie gehad met die intrasellulêre bakteriële ladings binne die makrofaag. ‘n Verandering in die metaboliese esterase aktiwiteit van persisters was deurlopend waargeneem. Laastens het die verhindering van fagositose persister getalle vermeerder terwyl fagosoom versuring geen effek gehad het nie. Die heterogenesiteit in die fisiologiese stand van M. tuberculosis beklemtoon hoe belangrik dit is om die aanpassings strategieë wat deur M. tuberculosis gebruik word om persisters te bevorder te verstaan. Die resultate en nuwe tegnieke verkry deur die bogenoemde studie kan bydra tot toekomstige navorsing oor die metaboliese eienskappe van M. tuberculosis en dus die ontwerp van antibiotika wat spesifiek persisters teiken, aanhelp.
Description
Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2021.
Keywords
Mycobacterium tuberculosis, Persisters, Flow cytometry, Bacterial heterogeneity