Molecular regulation of autophagy and metastasis in breast cancer: new insights into the role of serum amyloid A
Date
2022-04
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Introduction: Cytokines, growth factors and acute phase proteins present in the tumour
microenvironment regulate inflammatory responses and alter crosstalk between various
signalling pathways involved in the progression of cancer. It has recently been reported that
serum amyloid A (SAA), an acute-phase protein, mainly produced by hepatocytes during an
inflammatory response or infection, is also synthesized by cancer cells as well as other cells
in the tumour microenvironment. SAA can activate several signalling pathways, including
PI3K/Akt and MAPK signalling pathways, which are also known modulators of the intracellular
degradation process, autophagy. However, no knowledge exists regarding the relationship
between SAA and autophagy in breast cancer. Furthermore, it has been reported that SAA
can promote the metastasis of cancer cells. Therefore, the aim of this study was to investigate
the role of SAA in autophagy, metastasis and the activation of signalling pathways in in vitro
and in vivo models of breast cancer.
Methods: For the in vitro model the following cell lines were used, the triple-negative metastatic
breast cancer cell line, MDA-MB-231, the oestrogen (ER+) and progesterone positive (PR+)
epithelial-like cell line, MCF7, and the non-malignant breast epithelial cell line, MCF12A.
These cell lines were transiently transfected with a control vector, pcDNA3, and an
overexpression plasmid, pcDNA3-hSAA1, to overexpress SAA1. This study also investigated
whether SAA1/2 is required for tumourigenesis in an in vivo tumour-bearing mouse model with
double knockout of Saa1 and Saa2. We assessed autophagy, metastasis, proliferation,
apoptosis and signalling pathway marker activation in these two models.
Results: The overexpression of SAA1 in the MCF12A, MDA-MB-231 and MCF7 cell lines
resulted in an increase in cell viability and increased the expression of the proliferation marker,
MCM2, in the MCF12A and MCF7 cell lines. Furthermore, the overexpression of SAA in these
cell lines resulted in the inhibition of autophagy, while the expression of the cargo recruiter,
p62, was increased in the MCF7 cell line. SAA also promoted the migration of the MDA-MB-
231 and MCF7 cell lines, while no significant changes in the expression of the EMT markers
were detected. The overexpression of SAA1 decreased the activation of the MAPK and PI3K
signalling pathways in the MCF12A cell line, activated these pathways in the MDA-MB-231
cell line and inhibits Akt signalling in the MCF7 cell line. The overexpression of SAA1 resulted
in a decrease in the colocalization of pERK and LC3-II in the MCF12A cell line and increased
the colocalization of pERK and LC3-II in the MDA-MB-231 cell line. Furthermore, SAA1/2
knockout in vivo resulted in the induction of autophagy, while increasing the expression of
p62. The knockout of SAA1/2 also promoted the resistance of these cancer cells to apoptosis,
possibly through the regulation of autophagy. The knockout of SAA also inhibited the
mesenchymal phenotype by downregulating the expression of vimentin. Lastly, the knockout
of SAA1/2 resulted in the inhibition of the PI3K pathway protein, PKB/Akt, while increasing the
activation of the MAPK, p38. Furthermore, knockout of SAA1/2 resulted in an altered
inflammatory profile, evident in the decrease of plasma IL-1β, IL-6 and IL-10, while increasing
the plasma levels of MCP-1 and TNF-α.
Conclusions: We have determined for the first time a novel role for SAA in autophagy in breast
cancer cells. SAA overexpression inhibited autophagy in breast cancer cells. Additionally, SAA
promotes migration and proliferation through the cell-type specific regulation of the PI3K/Akt
and MAPK, ERK1/2 and p38, signalling pathways. Furthermore, the double knockout of
SAA1/2 induced autophagy, promoted tumour cell survival, inhibited metastasis and regulates
the activation of the PI3K/Akt and p38 signalling pathways. Double knockdown of SAA1/2 also
resulted in an altered inflammatory profile in vivo. Our results therefore suggest that SAA plays
an important role in breast cancer tumourigenesis.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Inleiding: Sitokiene, groeifaktore en akute fase proteïene in die gewas mikro-omgewing, reguleer inflammatoriese reaksies en verander die interaksie tussen verskillende seinoordragpaaie wat betrokke is by die bevordering van kanker. Daar word beweer dat SAA, ‘n akute fase proteïen, hoofsaaklik geproduseer word deur hepatosiete gedurende inflammasie of infeksie. Kanker en kanker-geassosieerde selle kan ook SAA produseer in die gewas mikro-omgewing. SAA kan verskeie seinoordragpaaie aktiveer, soos die PI3K- en MAPK-paaie, wat bekende modulators is van die intrasellulêre afbreekproses, autofagie. Die verhouding tussen SAA en autofagie moet nog ondersoek word in borskanker. Dit word ook beweer dat SAA metastase van kankerselle kan bevorder. Die oogmerk van die studie is om die rol van SAA in kanker te ondersoek deur die rol daarvan in autofagie, metastase en die activering van seinoordragpaaie te bepaal in in vitro en in vivo modelle van borskanker. Metodes: Die in vitro-model het gebruik gemaak van die volgende sellyne, naamlik die trippel- negatiewe metastatiese borskanker-sellyn, MDA-MB-231, die estrogeen- (ER+) en progesteroon-positiewe (PR+) epiteelagtige sellyn, MCF7, en die bors epiteelsellyn, MCF12A. Hierdie sellyne is tydelik met ‘n kontrole plasmied getransfekteer, naamlik pcDNA3, asook ‘n plasmied vir ooruitdrukking van SAA1, pcDNA3-hSAA1.. Ons het ook ondersoek ingestel of SAA nodig is vir tumorgenese in 'n in vivo kanker muismodel met dubbele uitklop van SAA1/2. Ons het autofagie, metastase, proliferasie, apoptose en seinoordragpad merker uitdrukking in die twee modelle ondersoek. Resultate: Die ooruitdrukking van SAA1 in die MCF12A, MDA-MB-231- en MCF7-sellyne het gelei tot 'n toename in sel lewensvatbaarheid en het die uitdrukking van die proliferasiemerker, MCM2, in die MCF12A en MCF7-sellyne, verhoog. Verder het die ooruitdrukking van SAA in hierdie sellyne gelei tot die inhibisie van autofagie, terwyl die uitdrukking van, p62, in die MCF7-sellyn verhoog was. SAA1 het ook die migrasie van die MDA-MB-231- en MCF7- sellyne bevorder, terwyl geen betekenisvolle veranderinge in die uitdrukking van die EMT- merkers opgemerk was nie. Die ooruitdrukking van SAA1 het die aktivering van die MAPK- en PI3K-seinoordragpaaie in die MCF12A-sellyn verminder, hierdie paaie in die MDA-MB- 231-sellyn geaktiveer en Akt aktivering in die MCF7-sellyn inhibeer. Laastens lei die ooruitdrukking van SAA1 tot 'n afname in die kolokalisasie van pERK en LC3-II in die MCF12A sellyn terwyl die kolokalisering van pERK en LC3-II in die MDA-MB-231 sellyn verhoog word. Verder het SAA1/2 uitklop in vivo gelei tot die induksie van autofagie, terwyl die uitdrukking van p62 verhoog is. Die uitklop van SAA1/2 het ook die weerstand van hierdie kankerselle teen apoptose bevorder, moontlik deur die regulering van autofagie. Die uitklop van SAA1/2 het ook die mesenkiemale fenotipe geïnhibeer deur die uitdrukking van vimentien af te reguleer. Die uitklop van SAA het gelei tot die verminderde aktivering van die PI3K- seinoordragpad komponent, PKB/Akt, terwyl die aktivering van die MAPK, p38, verhoog is. Verder het uitklop van SAA1/2 gelei tot 'n veranderde inflammatoriese profiel, duidelik sigbaar in die afname van plasma IL-1β, IL-6 en IL-10, terwyl die plasmavlakke van MCP-1 en TNF-α verhoog word. Gevolgtrekkings: Ons het vir die eerste keer bepaal dat SAA 'n unieke rol speel in autofagie in borskankerselle. SAA ooruitdrukking inhibeer autofagie in borskanker selle. Verder bevorder SAA migrasie en proliferasie deur die seltipe spesifieke regulasie van die PI3K/Akt en MAPK, ERK1/2 en p38, seinoordragpaaie. Dubbele uitklop van SAA1/2 het autofagie induseer, tumour sel oorlewing bevorder, metastase geinhibeer en het die aktivering van die PI3K/Ak en p38 seinoordragpaaie gereguleer. Dubbele uitklop van SAA1/2 het ook gelei tot ‘n veranderde inflammatoriese profile, in vivo. Hierdie resultate stel voor dat SAA1/2 ‘n belangrike rol speel gedurende tumorgenese van borskanker.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Inleiding: Sitokiene, groeifaktore en akute fase proteïene in die gewas mikro-omgewing, reguleer inflammatoriese reaksies en verander die interaksie tussen verskillende seinoordragpaaie wat betrokke is by die bevordering van kanker. Daar word beweer dat SAA, ‘n akute fase proteïen, hoofsaaklik geproduseer word deur hepatosiete gedurende inflammasie of infeksie. Kanker en kanker-geassosieerde selle kan ook SAA produseer in die gewas mikro-omgewing. SAA kan verskeie seinoordragpaaie aktiveer, soos die PI3K- en MAPK-paaie, wat bekende modulators is van die intrasellulêre afbreekproses, autofagie. Die verhouding tussen SAA en autofagie moet nog ondersoek word in borskanker. Dit word ook beweer dat SAA metastase van kankerselle kan bevorder. Die oogmerk van die studie is om die rol van SAA in kanker te ondersoek deur die rol daarvan in autofagie, metastase en die activering van seinoordragpaaie te bepaal in in vitro en in vivo modelle van borskanker. Metodes: Die in vitro-model het gebruik gemaak van die volgende sellyne, naamlik die trippel- negatiewe metastatiese borskanker-sellyn, MDA-MB-231, die estrogeen- (ER+) en progesteroon-positiewe (PR+) epiteelagtige sellyn, MCF7, en die bors epiteelsellyn, MCF12A. Hierdie sellyne is tydelik met ‘n kontrole plasmied getransfekteer, naamlik pcDNA3, asook ‘n plasmied vir ooruitdrukking van SAA1, pcDNA3-hSAA1.. Ons het ook ondersoek ingestel of SAA nodig is vir tumorgenese in 'n in vivo kanker muismodel met dubbele uitklop van SAA1/2. Ons het autofagie, metastase, proliferasie, apoptose en seinoordragpad merker uitdrukking in die twee modelle ondersoek. Resultate: Die ooruitdrukking van SAA1 in die MCF12A, MDA-MB-231- en MCF7-sellyne het gelei tot 'n toename in sel lewensvatbaarheid en het die uitdrukking van die proliferasiemerker, MCM2, in die MCF12A en MCF7-sellyne, verhoog. Verder het die ooruitdrukking van SAA in hierdie sellyne gelei tot die inhibisie van autofagie, terwyl die uitdrukking van, p62, in die MCF7-sellyn verhoog was. SAA1 het ook die migrasie van die MDA-MB-231- en MCF7- sellyne bevorder, terwyl geen betekenisvolle veranderinge in die uitdrukking van die EMT- merkers opgemerk was nie. Die ooruitdrukking van SAA1 het die aktivering van die MAPK- en PI3K-seinoordragpaaie in die MCF12A-sellyn verminder, hierdie paaie in die MDA-MB- 231-sellyn geaktiveer en Akt aktivering in die MCF7-sellyn inhibeer. Laastens lei die ooruitdrukking van SAA1 tot 'n afname in die kolokalisasie van pERK en LC3-II in die MCF12A sellyn terwyl die kolokalisering van pERK en LC3-II in die MDA-MB-231 sellyn verhoog word. Verder het SAA1/2 uitklop in vivo gelei tot die induksie van autofagie, terwyl die uitdrukking van p62 verhoog is. Die uitklop van SAA1/2 het ook die weerstand van hierdie kankerselle teen apoptose bevorder, moontlik deur die regulering van autofagie. Die uitklop van SAA1/2 het ook die mesenkiemale fenotipe geïnhibeer deur die uitdrukking van vimentien af te reguleer. Die uitklop van SAA het gelei tot die verminderde aktivering van die PI3K- seinoordragpad komponent, PKB/Akt, terwyl die aktivering van die MAPK, p38, verhoog is. Verder het uitklop van SAA1/2 gelei tot 'n veranderde inflammatoriese profiel, duidelik sigbaar in die afname van plasma IL-1β, IL-6 en IL-10, terwyl die plasmavlakke van MCP-1 en TNF-α verhoog word. Gevolgtrekkings: Ons het vir die eerste keer bepaal dat SAA 'n unieke rol speel in autofagie in borskankerselle. SAA ooruitdrukking inhibeer autofagie in borskanker selle. Verder bevorder SAA migrasie en proliferasie deur die seltipe spesifieke regulasie van die PI3K/Akt en MAPK, ERK1/2 en p38, seinoordragpaaie. Dubbele uitklop van SAA1/2 het autofagie induseer, tumour sel oorlewing bevorder, metastase geinhibeer en het die aktivering van die PI3K/Ak en p38 seinoordragpaaie gereguleer. Dubbele uitklop van SAA1/2 het ook gelei tot ‘n veranderde inflammatoriese profile, in vivo. Hierdie resultate stel voor dat SAA1/2 ‘n belangrike rol speel gedurende tumorgenese van borskanker.
Description
Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2022.
Keywords
Breast -- Cancer, Serum amyloid A, Metastasis, Autophagy, Cancer cells -- Proliferation, UCTD