Analysis of the role of transcription factors in enhancing drought tolerance in sugarcane (Saccharum spp.)
Date
2020-12
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Sugarcane is a large perennial grass of the genus Saccharum. Economically, this grass species is an important source of sugar for food purposes and biomass for biofuel production. However, the sustainability of production is greatly constrained by drought, which directly affects crop yield. Drought can lead to modification of metabolic processes in the plant, membrane disorder, disruptions and instabilities of many physiological and biochemical process, including photosynthesis and increased production of reactive oxygen species (ROS), which causes oxidative stress and can ultimately lead to plant death. It is therefore essential to continue developing cultivars with improved drought tolerance, which can possibly be achieved through the identification and introduction of genes that confer tolerance in crops. Transcription factors (TF) are gene regulators that control gene expression and consequently stress responses in plants. A single TF can regulate the expression of many target genes. This study aims at analysing the role of two TFs namely, BBX (B-Box Zinc Finger) and NAC2 (NAM, ATAF and CUC) in enhancing drought tolerance in sugarcane. For this, sugarcane was independently genetically transformed via particle bombardment with a BBX TF from Arabidopsis thaliana and a NAC2 TF from tomato. Attempts were also made to determine the subcellular localization of the AtBBX29 and SINAC2 genes but results were inconclusive due to poor microscopic imaging and faint GFP reporter signals. Transgene insertion was confirmed in putative transformed sugarcane through PCR analysis and transgene expression through semi-quantitative reverse transcriptase PCR. Transgenic sugarcane plantlets were planted ex vitro and drought pot trials were setup in the glasshouse. Once plants were deprived of water, phenotypic changes in transgenic sugarcane lines were compared to non-transgenic control sugarcane plants.
Under drought conditions, both AtBBX29 and SINAC2 overexpression in sugarcane enhanced drought tolerance. All transgenic plants exhibited higher survival and recovery rates than wild-type (WT) plants. Transgenic plants overexpressing AtBBX29 maintained relative water content (RWC) at levels not significant different from the WT plants. However, these plants maintained significantly higher chlorophyll fluorescent rates and stomatal conductance under mild and severe drought conditions. Under severe water-deficit stress, oxidative damage was reduced in BBX transgenic plants which exhibited low malondialdehyde (MDA) levels and less accumulation of reactive oxygen species (ROS) throughout the water-deficit stress period. The scavenging activity of antioxidants, which was present at significantly higher levels in the transgenic plants under severe water-deficit stress, most likely played a role in reducing the ROS levels. Transgenic plants also accumulated significantly more proline under mild and severe stress conditions compared to the WT plants. Abscisic acid levels varied between WT and transgenic plants exposed to drought. In addition, BBX transgenic sugarcane was grown to maturity (8 months) under a normal watering regime in the glasshouse where these plants displayed normal phenotypes and no significant difference in carbohydrate content compared to non-transgenic control plants. A preliminary drought trial was conducted with the SINAC2 transgenic sugarcane plants. Overexpression of SINAC2 enhanced drought tolerance in transgenic sugarcane plants exposed to water-deficit stress with higher survival rates seen in the transgenic lines compared to the WT plants. Transgenic plants overexpressing SINAC2 maintained significantly higher RWC levels and displayed less visual damaged such as leaf wilting and yellowing than the WT plants. Over the course of water-deficit period the root biomass increased in all genotypes, but less so in the transgenic plants, SINAC2 overexpression however enhanced root elongation. Transgenic plants also upheld photosynthesis, with high chlorophyll fluorescence and stomatal conductance seen in most transgenic plants under severe water-deficit stress.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Suikerriet is 'n groot meerjarige gras spesie van die genus Saccharum. Ekonomies is hierdie grassoort 'n belangrike suikerbron vir voedseldoeleindes en biomassa vir biobrandstof produksie. Die volhoubaarheid van produksie word egter baie beperk deur droogte, wat die oesopbrengs direk beïnvloed. Droogte kan lei tot verandering in metaboliese prosesse in die plant, membraan-ontwrigting, inhibering en versteurings van baie fisiologiese en biochemiese prosesse, insluitend fotosintese en verhoogde produksie van reaktiewe suurstofspesies (ROS), wat oksidatiewe skade veroorsaak en uiteindelik tot die dood van die plante kan lei. Dit is dus belangrik om voort te gaan met die ontwikkeling van kultivars met 'n verbeterde droogtetoleransie, wat moontlik bereik kan word deur die identifisering en invoeging van gene wat verdraagsaamheid verleen in gewasse. Transkripsiefaktore (TF) is geenreguleerders wat geenuitdrukking beheer en gevolglik stresreaksies by plante. 'n Enkele TF kan die uitdrukking van baie teikengene reguleer. Hierdie studie het ten doel om die rol van twee TF's, naamlik BBX (B-Boks Sink Vinger) en NAC2 (NAM, ATAF en CUC) te analiseer in die verbetering van die droogtetoleransie in suikerriet. Hiervoor is suikerriet onafhanklik geneties getransformeer via deeltjiebombardering met 'n BBX TF van Arabidopsis thaliana en 'n NAC2 TF van tamatie. Pogings is ook aangewend om die sub-sellulêre lokalisering van die AtBBX29- en SINAC2-gene te bepaal, maar die resultate was onoortuigend as gevolg van swak mikroskopiese beelde en flou GFP-verslagseine. Transgeeninplanting is bevestig in vermeende getransformeerde suikerriet deur middel van PKR-analise en transgeenuitdrukking deur middel van semi-kwalitatiewe tru-transkriptase PKR. Transgeniese suikerrietplantjies is ex vitro geplant en droogtepotproewe is in die glashuis opgestel. Nadat plante van water ontneem is, is fenotipiese veranderinge in transgeniese suikerrietlyne vergelyk met nie-transgeniese kontrole suikerrietplante. Onder droogtetoestande het die ooruitdrukking van beide AtBBX29 en SINAC2 in suikerriet droogtetoleransie verhoog. Al die transgeniese plante het hoër oorlewings- en herstelsyfers getoon as die wildtipe (WT) plante. Transgeniese plante wat AtBBX29 ooruitdruk, het die relatiewe waterinhoud (RWC) gehandhaaf op vlakke wat nie noemenswaardig verskil van die WT-plante nie. Hierdie plante het egter 'n beduidende hoër chlorofil fluoresensie koers en stomale-geleiding getoon onder droogtestres toestande. Onder hoë watertekort spanning, is oksidatiewe skade verminder in BBX transgeniese plante wat lae vlakke van malondialdehied (MDA) getoon het en minder opeenhoping van reaktiewe suurstofspesies (ROS) gedurende die strestydperk. Die de-aktiveringsaktiwiteit van antioksidante, wat teenwoordig was op aansienlike hoër vlakke in die transgeniese plante onder ernstige watertekort, het waarskynlik 'n rol gespeel in die verlaging van die ROS-vlakke. Transgeniese plante het ook aansienlik meer prolien opgebou onder matige en hoë strestoestande in vergelyking met die WT-plante. Absisieksuur vlakke het baie gewissel tussen WT en transgeniese plante wat aan droogte blootgestel was. Boonop is BBX-transgeniese suikerriet opgegroei tot volwassenheid (8 maande) onder normale besproeiing in die kweekhuis, waar die transgeniese plante normale fenotipes vertoon het en daar was geen noemenswaardige verskil in koolhidraatinhoud in vergelyking met nie-transgeniese kontrole plante nie. 'n Voorlopige droogtestudie is met die SINAC2-transgeniese suikerrietplante gedoen. Ooruitdrukking van SINAC2 het die droogtetoleransie verhoog by transgeniese suikerrietplante wat blootgestel was aan watertekorte, met hoër oorlewingsyfers in vergelyking met die WT-plante. Transgeniese plante het aansienlik hoër RWC-vlakke gehandhaaf en minder visueel skade getoon, soos blaarverwelking en vergeling, as die WT-plante. Gedurende die periode van watertekort het die wortelbiomassa by alle genotipes toegeneem, maar minder in die transgeniese plante, SINAC2 ooruitdrukking het egter die wortelverlenging verhoog. Transgeniese plante het ook fotosintese gehandhaaf, met 'n hoë chlorofil fluoresensie en stomale-geleiding wat by die meeste transgeniese plante onder ernstige watertekorte gesien is.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Suikerriet is 'n groot meerjarige gras spesie van die genus Saccharum. Ekonomies is hierdie grassoort 'n belangrike suikerbron vir voedseldoeleindes en biomassa vir biobrandstof produksie. Die volhoubaarheid van produksie word egter baie beperk deur droogte, wat die oesopbrengs direk beïnvloed. Droogte kan lei tot verandering in metaboliese prosesse in die plant, membraan-ontwrigting, inhibering en versteurings van baie fisiologiese en biochemiese prosesse, insluitend fotosintese en verhoogde produksie van reaktiewe suurstofspesies (ROS), wat oksidatiewe skade veroorsaak en uiteindelik tot die dood van die plante kan lei. Dit is dus belangrik om voort te gaan met die ontwikkeling van kultivars met 'n verbeterde droogtetoleransie, wat moontlik bereik kan word deur die identifisering en invoeging van gene wat verdraagsaamheid verleen in gewasse. Transkripsiefaktore (TF) is geenreguleerders wat geenuitdrukking beheer en gevolglik stresreaksies by plante. 'n Enkele TF kan die uitdrukking van baie teikengene reguleer. Hierdie studie het ten doel om die rol van twee TF's, naamlik BBX (B-Boks Sink Vinger) en NAC2 (NAM, ATAF en CUC) te analiseer in die verbetering van die droogtetoleransie in suikerriet. Hiervoor is suikerriet onafhanklik geneties getransformeer via deeltjiebombardering met 'n BBX TF van Arabidopsis thaliana en 'n NAC2 TF van tamatie. Pogings is ook aangewend om die sub-sellulêre lokalisering van die AtBBX29- en SINAC2-gene te bepaal, maar die resultate was onoortuigend as gevolg van swak mikroskopiese beelde en flou GFP-verslagseine. Transgeeninplanting is bevestig in vermeende getransformeerde suikerriet deur middel van PKR-analise en transgeenuitdrukking deur middel van semi-kwalitatiewe tru-transkriptase PKR. Transgeniese suikerrietplantjies is ex vitro geplant en droogtepotproewe is in die glashuis opgestel. Nadat plante van water ontneem is, is fenotipiese veranderinge in transgeniese suikerrietlyne vergelyk met nie-transgeniese kontrole suikerrietplante. Onder droogtetoestande het die ooruitdrukking van beide AtBBX29 en SINAC2 in suikerriet droogtetoleransie verhoog. Al die transgeniese plante het hoër oorlewings- en herstelsyfers getoon as die wildtipe (WT) plante. Transgeniese plante wat AtBBX29 ooruitdruk, het die relatiewe waterinhoud (RWC) gehandhaaf op vlakke wat nie noemenswaardig verskil van die WT-plante nie. Hierdie plante het egter 'n beduidende hoër chlorofil fluoresensie koers en stomale-geleiding getoon onder droogtestres toestande. Onder hoë watertekort spanning, is oksidatiewe skade verminder in BBX transgeniese plante wat lae vlakke van malondialdehied (MDA) getoon het en minder opeenhoping van reaktiewe suurstofspesies (ROS) gedurende die strestydperk. Die de-aktiveringsaktiwiteit van antioksidante, wat teenwoordig was op aansienlike hoër vlakke in die transgeniese plante onder ernstige watertekort, het waarskynlik 'n rol gespeel in die verlaging van die ROS-vlakke. Transgeniese plante het ook aansienlik meer prolien opgebou onder matige en hoë strestoestande in vergelyking met die WT-plante. Absisieksuur vlakke het baie gewissel tussen WT en transgeniese plante wat aan droogte blootgestel was. Boonop is BBX-transgeniese suikerriet opgegroei tot volwassenheid (8 maande) onder normale besproeiing in die kweekhuis, waar die transgeniese plante normale fenotipes vertoon het en daar was geen noemenswaardige verskil in koolhidraatinhoud in vergelyking met nie-transgeniese kontrole plante nie. 'n Voorlopige droogtestudie is met die SINAC2-transgeniese suikerrietplante gedoen. Ooruitdrukking van SINAC2 het die droogtetoleransie verhoog by transgeniese suikerrietplante wat blootgestel was aan watertekorte, met hoër oorlewingsyfers in vergelyking met die WT-plante. Transgeniese plante het aansienlik hoër RWC-vlakke gehandhaaf en minder visueel skade getoon, soos blaarverwelking en vergeling, as die WT-plante. Gedurende die periode van watertekort het die wortelbiomassa by alle genotipes toegeneem, maar minder in die transgeniese plante, SINAC2 ooruitdrukking het egter die wortelverlenging verhoog. Transgeniese plante het ook fotosintese gehandhaaf, met 'n hoë chlorofil fluoresensie en stomale-geleiding wat by die meeste transgeniese plante onder ernstige watertekorte gesien is.
Description
Thesis (MScAgric)--Stellenbosch University, 2020.
Keywords
Sugarcane -- Analysis, Sugarcane -- Drought tolerance, Transgenic plants -- Effect of drought on, UCTD