In vitro and in vivo characterisation of SARS-CoV-2 wildtype, Beta, Delta and Omicron variants of concern : growth kinetics and viral shedding
Date
2023-03
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH SUMMARY: Background and Introduction: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is a novel coronavirus that emerged in Wuhan, China, in December 2019. By October 2022, SARS-CoV-2 had caused more than 626 million known cases worldwide, resulting in over 6.5 million deaths. South Africa reported over 4 million cases and over 100 000 deaths, experiencing five epidemic waves each caused by a novel variant of concern (VOC), apart from the first pandemic wave. The first wave was caused by the SARS-CoV-2 wild-type (WT), the second SARS-CoV-2 Beta VOC, the third SARS-CoV-2 Delta VOC, the fourth SARS-CoV-2 Omicron VOC and the fifth wave by SARS-CoV-2 Omicron subvariants. Each VOC possessed a unique set of mutations that resulted in augmented transmissibility and infectivity. These augmented characteristics can be impacted by multiple factors, including individual patient viral shedding dynamics and replicative fitness. Infectiousness has been inferred from the RNA concentration in a sample, whilst useful, multiple studies have revealed that the ratio between RNA and infectious virus particles varies greatly during active infection. Therefore, a patient’s true infectiousness can only be determined through virus isolation. Augmented replication of a particular VOC can translate into a competitive advantage. Replicative fitness can be assessed through experiments designed to compare the rate of change of the number of virus particles over time, known as replication kinetics. Understanding these two factors can provide information on why different VOC were able to transmit differently and provide further insight into interpreting clinical results. Aim and objectives: This study had two main aims, firstly, to investigate the replicative fitness of SARS-CoV-2 WT, Beta and Delta. Secondly, to characterize the viral load and infectious particle shedding in a group of vaccinated and boosted German tourists that presented with breakthrough infections, referring to infections diagnosed at least 14 days after the last dose of a full vaccination course and/or a booster vaccination, with SARS-CoV-2 Omicron VOC. This was to be accomplished by isolating all virus variants circulating in South Africa, producing a virus stock of each of these and performing replication kinetic experiments, and by monitoring viral RNA concentrations and successful isolation outcomes over time amongst the breakthrough infections cohort. Methods: Replication-competent SARS-CoV-2 was isolated from PCR-positive patient samples submitted to the National Health Laboratory Service (NHLS), Tygerberg Business Unit, Cape Town, South Africa. Samples were used to inoculate Vero E6 and H1299-E3 cells, after which the cell cultures were grown at 37°C and monitored daily for cytopathic effects (CPE). When >80% CPE was observed the supernatant was harvested and sub-cultured to produce a working stock. Replication kinetic experiments were performed on Vero E6 cells, and samples for analysis were taken at different time points post-infection (p.i.). RNA and infectious particle concentrations were determined. To characterize the infectious period, samples were collected daily, up to day eight of symptom onset, from a cohort of 11 German tourists who were fully vaccinated that presented with breakthrough Omicron infections. RNA concentrations were determined using RT-PCR and the infectiousness of the patients was assessed by attempting virus isolation from each sample. Results: Virus isolation was attempted from 136 SARS-CoV-2 positive patient samples and yielded 17 virus isolates - three SARS-CoV-2 WT, five SARS-CoV-2 Beta VOC, four SARS-CoV-2 Delta VOC, one SARS-CoV-2 Alpha VOC and three SARS-CoV-2 Omicron BA.1 VOC. Attempts to isolate Omicron sub-lineages BA.2, BA.4 and BA.5 as well as SARS-CoV-2 C.1.2 were unsuccessful. Beta showed a similar growth curve when compared to WT, indicating no significant replicative advantage, whereas Delta had a significantly steeper growth curve, indicating an enhanced replication rate for Delta. Characterisation of viral loads amongst the study cohort, despite a high level of heterogeneity between patients, showed an increase up to day three followed by decreasing RNA concentrations thereafter. Virus isolation was more likely to be successful before day five from symptom onset and associated with higher viral loads, whilst also showing high levels of heterogeneity between patients. Conclusion: In line with the aims and objectives of this study at least one virus stock was successfully produced from the SARS-CoV-2 VOC that circulated in South Africa, apart from Omicron BA.2, BA.4 and BA.5. Analysis of VOC growth kinetics using Vero E6 cells revealed that Beta did not differ from the WT. Increased transmission associated with Beta is therefore likely due to other factors, such as immune escape and receptor affinity. Delta showed a significant replication advantage over Beta and WT, which likely played a role in its increased transmissibility. Results from the breakthrough infection cohort emphasised a high level of heterogeneity in RNA concentrations and infectious particle shedding between patients. Patients appeared to be more infectious closer to symptom onset and when RNA concentrations were higher, in line with other studies. This research highlights the importance of virus culture techniques in understanding the in vitro characteristics of viruses.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Agtergrond en inleading: Ernstige akute respiratoriese sindroom koronavirus 2 (of SARS-CoV-2) is 'n nuwe koronavirus wat in Desember 2019 in Wuhan, China, geidentifiseer is. Teen Oktober 2022 het SARS-CoV-2 wereldwyd meer as 626 miljoen bevestigde gevalle veroorsaak, wat meer as 6,5 miljoen sterftes tot gevolg gehad het. Suid-Afrika het meer as 4 miljoen gevalle en meer as 100 000 sterftes aangemeld, en het vyf epidemiese golwe ondervind wat elk veroorsaak is deur 'n nuwe bekommerenswaardig variant (of variant of concern [VOC]), bo en behalwe die eerste pandemiegolf. Die eerste golf is veroorsaak deur die SARS-CoV-2 wilde tipe (WT), die tweede was die SARS-CoV-2 Beta VOC, die derde SARS-CoV-2 Delta VOC, die vierde SARS-CoV-2 Omicron VOC en die vyfde golf was veroorsaak deur SARS-CoV-2 Omicron-subvariante. Elke VOC het 'n unieke stel mutasies gehad wat gelei het tot 'n hoer transmissie en infektiwiteit. Hierdie verhoogde patogenisiteit kan beinvloed word deur verskeie faktore, bv. individuele pasient virale afskeidingsdinamika en replikasie fiksheid. Aansteeklikheid is afgelei van die RNS-konsentrasie in 'n monster, hoewel dit nuttig is, het verskeie studies aan die lig gebring dat die verhouding tussen RNS en infektiewe partikels baie verskil tydens aktiewe infeksie. Daarom kan die ware aansteeklikheid van 'n pasient slegs deur virusisolasie bepaal word. Opgegradeerde replikasie van 'n spesifieke VOC kan lei tot 'n kompeterende voordeel. Replikasie fiksheid kan geevalueer word deur eksperimente wat ontwerp is om die tempo van verandering in die aantal virusdeeltjies oor tyd te vergelyk, ook bekend as replikasiekinetika. Beter begrip van hierdie twee faktore, kan moontlik verklaar waarom verskillende VOC verskillende transmissie patrone het en ook meer lig werp op die interpretasie van kliniese resultate. Doel en doelstellings: Hierdie studie was daarop gemik om die repliserende fiksheid van SARS-CoV-2 WT, Beta en Delta te ondersoek en om die virale lading en afskeiding van aansteeklike partikels te beskryf in 'n groep gevaksineerde individue wat ook die booster-entstof ontvang het, wat deubraakinfeksies met SARS-CoV-2 Omicron VOC gekry het. Dit sou moontlik wees deur alle sirkulerende virusvariante in Suid-Afrika, te isoleer, 'n virusvoorraad van elk van hierdie te produseer en replikasie kinetiese eksperimente uit te voer, en deur virale ribonukleiensuur (RNS)-konsentrasies en suksesvolle isolasie-uitkomste oor tyd in die groep individue met deurbraakinfeksies te monitor. Metodes: Replikasie-kompeterende SARS-CoV-2 is geisoleer van polimerase kettingreaksie (PKR)-positiewe pasientmonsters wat na die Tygerberg afdeling van die Nasionale Gesondheids Laboratoriumdienste (NGLD), Kaapstad, Suid-Afrika, gestuur is vir analise. Monsters is op Vero E6- en H1299-E3-selle gekweek en geisoleer, waarna die selkulture by 37°C onderhou en daagliks gemonitor is vir sitopatiese effek (SPE). Sodra > 80% SPE sigbaar was, is die supernaat van die kultuur versamel en onderverdeel om 'n werkende voorraad te produseer. Replikasie kinetiese eksperimente is op Vero E6-selle uitgevoer, en monsters is op verskillende stadiums na infeksie geneem vir ontleding. RNS en die konsentrasie van infektiewe partikels is bepaal. Om die infektiewe periode te karakteriseer, is monsters daagliks vir 8 dae lank vandat simptome begin het, in ‘n groep van 11 Duitse toeriste wat volledig ingeent was en deurbraak Omicron-infeksie gekry het, versamel. RNS-konsentrasie is met behulp van RT-PKR bepaal en die infektiwiteit van die pasiente is geevalueer deur te poog om virusisolasie van elke monster uit te voer. Resultate: Virusisolasie is probeer op 136 positiewe SARS-CoV-2 pasientmonsters en 17 virusisolate is gevind - drie SARS-CoV-2 WT, vyf SARS-CoV-2 Beta VOC, vier SARS-CoV-2 Delta VOC, een SARS-CoV-2 Alpha VOC en drie SARS-CoV-2 Omicron BA.1 VOC. Pogings om die sublyne van Omicron BA.2, BA.4 en BA.5 te isoleer, sowel as SARS-CoV-2 C.1.2 was onsuksesvol. Beta het 'n soortgelyke groeikurwe getoon as die WT, wat geen noemenswaardige repliserende voordeel impliseer nie, terwyl Delta 'n aansienlik steiler groeikurwe gehad het, wat betekend dat Delta oor 'n beter replikasietempo beskik. Die karakterisering van die virale ladings in die studiegroep, ondanks 'n hoe vlak van heterogeniteit tussen pasiente, het 'n toename tot dag drie getoon, gevolg deur die vermindering van RNS-konsentrasies daarna. Virusisolasie sou waarskynlik suksesvol wees binne vyf dae van die aanvang van simptome, veral in gevalle met hoer virale ladings, terwyl dit ook hoe vlakke van heterogeniteit tussen pasiente toon. Gevolgtrekking: In ooreenstemming met die doel en doelstellings van hierdie studie, en afgesien van Omicron BA.2, BA.4 en BA.5, is ten minste nog een virusvoorraad suksesvol vervaardig uit die SARS-CoV-2 VOC wat in Suid-Afrika versprei het. Ontleding van die groeikurwes van die VOC-kinetika in Vero E6-selle, het gewys dat Beta nie van die WT verskil nie. Verhoogde transmissie wat met Beta verband hou, is dus waarskynlik as gevolg van ander faktore, soos immuun ontsnapping en reseptor affiniteit. Delta het 'n beduidende replikasievoordeel bo Beta en WT getoon, wat waarskynlik 'n rol gespeel het in die verhoogde transmissie daarvan. Resultate uit die deurbraak-studiegroep beklemtoon 'n hoe vlak van heterogeniteit in RNS-konsentrasies en infektiewe partikel-afskeiding tussen pasiente. Dit lyk asof pasiente meer aansteeklik is tydens die aanvang van simptome en wanneer RNA-konsentrasies hoer is, in ooreenstemming met ander studies. Hierdie navorsing beklemtoon die belangrikheid van viruskultuurtegnieke om die in vitro-eienskappe van virusse te verstaan.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Agtergrond en inleading: Ernstige akute respiratoriese sindroom koronavirus 2 (of SARS-CoV-2) is 'n nuwe koronavirus wat in Desember 2019 in Wuhan, China, geidentifiseer is. Teen Oktober 2022 het SARS-CoV-2 wereldwyd meer as 626 miljoen bevestigde gevalle veroorsaak, wat meer as 6,5 miljoen sterftes tot gevolg gehad het. Suid-Afrika het meer as 4 miljoen gevalle en meer as 100 000 sterftes aangemeld, en het vyf epidemiese golwe ondervind wat elk veroorsaak is deur 'n nuwe bekommerenswaardig variant (of variant of concern [VOC]), bo en behalwe die eerste pandemiegolf. Die eerste golf is veroorsaak deur die SARS-CoV-2 wilde tipe (WT), die tweede was die SARS-CoV-2 Beta VOC, die derde SARS-CoV-2 Delta VOC, die vierde SARS-CoV-2 Omicron VOC en die vyfde golf was veroorsaak deur SARS-CoV-2 Omicron-subvariante. Elke VOC het 'n unieke stel mutasies gehad wat gelei het tot 'n hoer transmissie en infektiwiteit. Hierdie verhoogde patogenisiteit kan beinvloed word deur verskeie faktore, bv. individuele pasient virale afskeidingsdinamika en replikasie fiksheid. Aansteeklikheid is afgelei van die RNS-konsentrasie in 'n monster, hoewel dit nuttig is, het verskeie studies aan die lig gebring dat die verhouding tussen RNS en infektiewe partikels baie verskil tydens aktiewe infeksie. Daarom kan die ware aansteeklikheid van 'n pasient slegs deur virusisolasie bepaal word. Opgegradeerde replikasie van 'n spesifieke VOC kan lei tot 'n kompeterende voordeel. Replikasie fiksheid kan geevalueer word deur eksperimente wat ontwerp is om die tempo van verandering in die aantal virusdeeltjies oor tyd te vergelyk, ook bekend as replikasiekinetika. Beter begrip van hierdie twee faktore, kan moontlik verklaar waarom verskillende VOC verskillende transmissie patrone het en ook meer lig werp op die interpretasie van kliniese resultate. Doel en doelstellings: Hierdie studie was daarop gemik om die repliserende fiksheid van SARS-CoV-2 WT, Beta en Delta te ondersoek en om die virale lading en afskeiding van aansteeklike partikels te beskryf in 'n groep gevaksineerde individue wat ook die booster-entstof ontvang het, wat deubraakinfeksies met SARS-CoV-2 Omicron VOC gekry het. Dit sou moontlik wees deur alle sirkulerende virusvariante in Suid-Afrika, te isoleer, 'n virusvoorraad van elk van hierdie te produseer en replikasie kinetiese eksperimente uit te voer, en deur virale ribonukleiensuur (RNS)-konsentrasies en suksesvolle isolasie-uitkomste oor tyd in die groep individue met deurbraakinfeksies te monitor. Metodes: Replikasie-kompeterende SARS-CoV-2 is geisoleer van polimerase kettingreaksie (PKR)-positiewe pasientmonsters wat na die Tygerberg afdeling van die Nasionale Gesondheids Laboratoriumdienste (NGLD), Kaapstad, Suid-Afrika, gestuur is vir analise. Monsters is op Vero E6- en H1299-E3-selle gekweek en geisoleer, waarna die selkulture by 37°C onderhou en daagliks gemonitor is vir sitopatiese effek (SPE). Sodra > 80% SPE sigbaar was, is die supernaat van die kultuur versamel en onderverdeel om 'n werkende voorraad te produseer. Replikasie kinetiese eksperimente is op Vero E6-selle uitgevoer, en monsters is op verskillende stadiums na infeksie geneem vir ontleding. RNS en die konsentrasie van infektiewe partikels is bepaal. Om die infektiewe periode te karakteriseer, is monsters daagliks vir 8 dae lank vandat simptome begin het, in ‘n groep van 11 Duitse toeriste wat volledig ingeent was en deurbraak Omicron-infeksie gekry het, versamel. RNS-konsentrasie is met behulp van RT-PKR bepaal en die infektiwiteit van die pasiente is geevalueer deur te poog om virusisolasie van elke monster uit te voer. Resultate: Virusisolasie is probeer op 136 positiewe SARS-CoV-2 pasientmonsters en 17 virusisolate is gevind - drie SARS-CoV-2 WT, vyf SARS-CoV-2 Beta VOC, vier SARS-CoV-2 Delta VOC, een SARS-CoV-2 Alpha VOC en drie SARS-CoV-2 Omicron BA.1 VOC. Pogings om die sublyne van Omicron BA.2, BA.4 en BA.5 te isoleer, sowel as SARS-CoV-2 C.1.2 was onsuksesvol. Beta het 'n soortgelyke groeikurwe getoon as die WT, wat geen noemenswaardige repliserende voordeel impliseer nie, terwyl Delta 'n aansienlik steiler groeikurwe gehad het, wat betekend dat Delta oor 'n beter replikasietempo beskik. Die karakterisering van die virale ladings in die studiegroep, ondanks 'n hoe vlak van heterogeniteit tussen pasiente, het 'n toename tot dag drie getoon, gevolg deur die vermindering van RNS-konsentrasies daarna. Virusisolasie sou waarskynlik suksesvol wees binne vyf dae van die aanvang van simptome, veral in gevalle met hoer virale ladings, terwyl dit ook hoe vlakke van heterogeniteit tussen pasiente toon. Gevolgtrekking: In ooreenstemming met die doel en doelstellings van hierdie studie, en afgesien van Omicron BA.2, BA.4 en BA.5, is ten minste nog een virusvoorraad suksesvol vervaardig uit die SARS-CoV-2 VOC wat in Suid-Afrika versprei het. Ontleding van die groeikurwes van die VOC-kinetika in Vero E6-selle, het gewys dat Beta nie van die WT verskil nie. Verhoogde transmissie wat met Beta verband hou, is dus waarskynlik as gevolg van ander faktore, soos immuun ontsnapping en reseptor affiniteit. Delta het 'n beduidende replikasievoordeel bo Beta en WT getoon, wat waarskynlik 'n rol gespeel het in die verhoogde transmissie daarvan. Resultate uit die deurbraak-studiegroep beklemtoon 'n hoe vlak van heterogeniteit in RNS-konsentrasies en infektiewe partikel-afskeiding tussen pasiente. Dit lyk asof pasiente meer aansteeklik is tydens die aanvang van simptome en wanneer RNA-konsentrasies hoer is, in ooreenstemming met ander studies. Hierdie navorsing beklemtoon die belangrikheid van viruskultuurtegnieke om die in vitro-eienskappe van virusse te verstaan.
Description
Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2023.