Investigating the effect of simulated Ischemia on phosphatases : comparing a cardiomyocytes (H9c2) cell line with a breast cancer (MDA-MB 231) cell line

Maumela, Lutendo (2020-03)

Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2020.

Thesis

Background: Reversible phosphorylation is responsible for an estimated 30% of protein regulation. Protein phosphorylation is catalysed by protein kinases and dephosphorylation by protein phosphatases. Ischemia, which is characterised by reduced blood flow to tissue and hypoxia has been implicated in causing pathology in the regulation of proteins involved in signalling both in the heart and in cancer cells. Methods: 10000 cells/100µl/well of H9c2 and 25000 cells/100µl/well of MDA-MB 231 were cultured in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with 10 % Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 % Penicilin Streptomycin (PenStrep). Incubation was done in a sterile environment in 95 % atmospheric air in 5 % CO2 at 37 ºC in a humidified atmosphere. At 70 % - 80 % confluence, ischemia was simulated by Modified Esumi Buffer in conjugation with exposure to a hypoxic gas mixture [0% O2/5 % CO2/95 % N2 (H9c2) or 0.5 % O2/5 % CO2/balance N2 (MDA-MB 231)]. Incubation for simulated ischemia (SI) was done for 2 hours and acidic reperfusion for 30 minutes. Phosphatase activity was measured using both a p-nitrophenol phosphate (pNPP), as well as a 6,8-difluro-4methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP) assay. Phosphatase expression was measured by Western blotting. Cell viability was measured using an ATP assay, as well as both propidium iodide (PI) and JC-1 staining. Cells were pharmacologically manipulated by administering cantharidin (2 µM and 5 µM), an inhibitor of both PP2A and PP1 and FTY 720 (1 µM and 5 µM), an activator of PP2A. All experiments were repeated three or four times on three or four different days. All data was analysed using Graphpad Prism version 5. All the data was expressed as mean ± standard error of the mean (SEM). For comparison between two groups, the student T-test was used. For multiple comparisons, one-way ANOVA with Bonferroni post hoc test was used. Differences were considered statistically significant at p < 0.05. Results: Energy status was measured as ATP levels revealing that SI reduced ATP levels in both H9c2 cells (control: 1.000 ± 0.000 Arbitrary Unit (AU) vs SI: 0.597 ± 0.042 AU; n = 3; p < 0.001) and MDA-MB 231 cells (control: 1.000 ± 0.000 AU vs SI: 0.458 ± 0.025 AU; n = 4; p < 0.01). JC-1 stain showed no mitochondrial impairment and PI staining detected no significant cell membrane breakage in both H9c2 and MDA-MB 231 cell lines treated with SI. pNPP and DiFMUP assays showed no noticeable change in the activity of protein phosphatases in both the MDA-MB 231 and H9c2 under SI conditions. The total expression of Akt/PKB in MDA-MB 231 cell line showed a statistically significant reduction following 2 hours SI (control: 1.000 ± 0.000 AU vs SI: 0.556 ± 0.027 AU; n = 3; p < 0.01). In addition, the expression of PP2Ac was also inclined in MDA-MB 231 cell line due to SI (control: 1.482 x 107 ± 8.715 x 105 AU vs SI: 1.964 x 107 ± 1.406 x 106 AU; n = 3; p < 0.05). Protein phosphatase 2A was elected for pharmacological manipulation in both H9c2 and MDA-MB 231 cell lines under SI conditions. Normoxic MDA-MB 231 cell line was treated with 1 µM FTY 720 to show an increase in PI fluorescence (normoxia: 199.5 ± 8.381 relative fluorescence units (RFU) vs normoxia + 1 µM FTY 720: 228.1 ± 2.902 RFU; n= 4; p < 0.05). Data assessed by JC-1 staining showed that 5 µM cantharidin treatment under SI conditions reduced the mitochondrial function and integrity of the MDA-MB 231 cell line (SI: 1.000 ± 0.000 RFU vs SI + 5 µM cantharidin: 0.625 ± 0.112 RFU; n= 4; p < 0.01). JC-1 image analysis showed that SI + 5 µM cantharidin also reduced mitochondrial function and integrity in H9c2 cells (SI: 1.000 ± 0.000 RFU vs SI + 5 µM cantharidin: 0.285 ± 0.059 RFU; n= 3; p < 0.01). Discussion and conclusion: Two hours SI did not significantly influence phosphatase activity in both H9c2 and MDA-MB 231 cell lines. In MDA-MB 231 cell line SI was associated with an increase in the expression of PP2Ac. SI caused a significant reduction in ATP levels in both H9c2 and MDAMB 231 cell lines as expected. However, 2 hours SI did not induce cell death as measured by PI and JC-1 staining. Pharmacological inhibition of PP2A with 5 µM cantharidin in combination with SI protected the cells by reducing the consumption of ATP in H9c2 cells. Other studies showed that the inhibition of PP2A indeed protects heart cells from ischemia whereas, studies done in cancer report that the inhibition of PP2A induces cell death. Surprisingly, even though the inhibition of PP2A by 5 µM cantharidin under SI conditions reduced the consumption of ATP in H9c2 cells, JC-1 image analysis reported that it also reduced mitochondrial function and integrity. SI + 5 µM cantharidin also reduced mitochondrial function and integrity in MDA-MB 231 cell line. As stated, in the heart the inhibition of PP2A has been shown by other researchers to be protective. The activation of PP2A by 1 µM FTY 720 in MDA-MB 231 cell line under normoxic conditions induced cell death as measured by PI. Other studies have showed that it is indeed the activation of PP2A that induces cell death in cancer cells, making it a tumour suppressor. Interestingly, an increasing body of evidence shows that the inhibition of PP2A can also lead to cell death, making it a tumour promotor in other types of cancer. It is therefore concluded that PP2A may play a dual role in cell death depending on the targeted holoenzyme and maybe also cell type. More studies must be done to investigate the role of PP2A in cell death in different cell types, as well as to identify which holoenzymes should be targeted for a desired outcome. PP2A remains of great interest in the field of research for cancer therapy as well as cardioprotection.

Agtergrond: Dit word beraam dat omkeerbare fosforilasie betrokke is by nagenoeg 30% van proteïen-regulering. Proteïen fosforilering word gekataliseer deur proteïen kinases, terwyl defosforilering gemedieer word deur proteïen fosfatasases. Daar is al gevind dat iskemie, wat gekenmerk word deur ‘n afname in bloedvoorsiening asook hipoksie, kan lei na patologie in terme van die regulering van proteïene betrokke in seintransduksie in beide die hart-, asook kankerselle. Metodes: 10000 selle/100µL/put van H9c2 en 25000 selle/100µL/put van MDA-MB-231 is gekweek in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevul met 10% fetale bovienserum (FBS) en 1% Penisillien Streptomisien (PenStrep). Selle is gehandhaaf in ‘n steriele omgewing in 95% atmosferiese lug en 5% CO2 teen 37°C in ‘n gehumidifiseerde atmosfeer. Wanneer selle 70%-80% konfluensie bereik het is hulle blootgestel aan simuleerde iskemie (SI) wat bestaan het uit inkubasie met ‘n gemodifiseerde Esumi buffer, tesame met blootstelling aan ‘n hipoksie-gasmengsel [0% O2/5 % CO2/95 % N2 (H9c2) of 0.5 % O2/5 % CO2/balans N2 (MDA-MB 231)]. Selle is vir 2 ure aan hierdie SI ingreep blootgestel, gevolg deur 30 minutes van suur-herperfusie. Fosfatase aktiwiteit is gemeet deur gebruik te maak van twee verskillende analises: die p-nitrofenolfosfaat (pNPP) toets, asook die 6,8difluro-4metielumbelliferielfosfaat (DiFMUP) toets. Die uitdrukking van fosfatases is bepaal met behulp van Westerse klad. Sellewensvatbaarheid is gemeet deur gebruik te maak van ‘n ATP toets, asook propidium jodied (PI) en JC-1 kleuring. Selle is farmakologies gemanipuleer deur óf ‘n inhibeerder (cantharidin, teen twee dosisse: 2 µM en 5 µM) óf ‘n aktiveerder (FTY 720, teen twee dosisse: 1 µM en 5 µM) van PP2A toe te dien. Alle eksperimente is drie of vier maal herhaal en gedoen op drie of vier verskillende dae. Alle data is statisties geanaliseer deur gebruik te maak van Graphpad Prism weergawe 5. Alle data is uitgedruk as gemiddeld±standaard fout van die gemiddeld (SEM). Waar twee groepe met mekaar vergelyk is, is die studente T-toets gebruik. In die geval van meervoudige vergelykings is eenrigting ANOVA met die Bonferroni toets gebruik. Verskille is as statisties beduidend geag indien die p-waarde laer as 0.05 is. Resultate: Die ATP toets het getoon dat SI wel ATP vlakke verlaag het in H9c2 selle (kontrole: 1.000 ± 0.000 Arbitrêre Eenhede (AE) vs SI: 0.597 ± 0.042 AE; n = 3; p < 0.001). SI het ook ‘n afname in ATP vlakke in MDA-MB-231 selle geïnduseer (kontrole: 1.000 ± 0.000 AE vs SI: 0.458 ± 0.025 AE; n = 4; p < 0.01). SI was egter nie geassosieer met ‘n toename in seldood in H9c2 en MDA-MB-231 selle nie, soos bepaal deur PI en JC-1 kleuring. SI het ook geen invloed op fosfatase aktiwiteit gehad in beide H9c2 en MDA-MB-231 selle nie, soos bepaal deur beide die pNPP en die DiFMUP toets. Die uitdrukking van PKB/Akt in MDA-MB-231 selle was wel beduidend laer na 2 ure van iskemie (kontrole: 1.000 ± 0.000 AE vs SI: 0.556 ± 0.027 AE; n = 3; p < 0.01). Tesame hiermee was daar ‘n beduidende toename in die uitdrukking van PP2Ac in die MDA-MB 231 selle in assosiasie met iskemie (kontrole: 1.482 x 107 ± 8.715 x 102 AE vs SI: 1.964 x 107 ± 1.406 x 106 AE; n = 3; p < 0.05) soos bepaal met ‘n studente T-toets. Behandeling met ‘n kombinasie van SI en middels (cantharidin en FTY 720) was geassosieer met ‘n afname in ATP vlakke in beide H9c2 en MDA-MB 231 selle. Daar was egter wel ‘n afname in die verbruik van ATP in H9c2 selle behandel met 5µM cantharidin onder SI kondisies, in vergelyking met die standaard SI-alleen behandeling. Behandeling met 1 µM FTY 720 het gelei na ‘n toename in PI fluorosensie, kenmerkend van nekrose, in normoksiese MDA-MB 231 selle (normoksie: 199.5 ± 8.381 relatiewe fluorosensie eenhede (RFE) vs normoksie + 1 µM FTY 720: 228.1 ± 2.902 RFE; n= 4; p < 0.05). 5 µM FTY 720 het egter verbasend geen effek ontlok nie. Data gegenereer deur die plaatleser het getoon dat 5µM cantharidin behandeling tesame met SI blootstelling mitochondriale funksie en integriteit verlaag het, soos bepaal deur JC-1 kleuring (SI: 1.000 ± 0.000 RFU vs 5µM cantharidin: 0.625 ± 0.112 RFU; n= 4; p < 0.01). Beeld analiese van die JC-1 kleuring inAgtergrond: Dit word beraam dat omkeerbare fosforilasie betrokke is by nagenoeg 30% van proteïen-regulering. Proteïen fosforilering word gekataliseer deur proteïen kinases, terwyl defosforilering gemedieer word deur proteïen fosfatasases. Daar is al gevind dat iskemie, wat gekenmerk word deur ‘n afname in bloedvoorsiening asook hipoksie, kan lei na patologie in terme van die regulering van proteïene betrokke in seintransduksie in beide die hart-, asook kankerselle. Metodes: 10000 selle/100µL/put van H9c2 en 25000 selle/100µL/put van MDA-MB-231 is gekweek in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevul met 10% fetale bovienserum (FBS) en 1% Penisillien Streptomisien (PenStrep). Selle is gehandhaaf in ‘n steriele omgewing in 95% atmosferiese lug en 5% CO2 teen 37°C in ‘n gehumidifiseerde atmosfeer. Wanneer selle 70%-80% konfluensie bereik het is hulle blootgestel aan simuleerde iskemie (SI) wat bestaan het uit inkubasie met ‘n gemodifiseerde Esumi buffer, tesame met blootstelling aan ‘n hipoksie-gasmengsel [0% O2/5 % CO2/95 % N2 (H9c2) of 0.5 % O2/5 % CO2/balans N2 (MDA-MB 231)]. Selle is vir 2 ure aan hierdie SI ingreep blootgestel, gevolg deur 30 minutes van suur-herperfusie. Fosfatase aktiwiteit is gemeet deur gebruik te maak van twee verskillende analises: die p-nitrofenolfosfaat (pNPP) toets, asook die 6,8difluro-4metielumbelliferielfosfaat (DiFMUP) toets. Die uitdrukking van fosfatases is bepaal met behulp van Westerse klad. Sellewensvatbaarheid is gemeet deur gebruik te maak van ‘n ATP toets, asook propidium jodied (PI) en JC-1 kleuring. Selle is farmakologies gemanipuleer deur óf ‘n inhibeerder (cantharidin, teen twee dosisse: 2 µM en 5 µM) óf ‘n aktiveerder (FTY 720, teen twee dosisse: 1 µM en 5 µM) van PP2A toe te dien. Alle eksperimente is drie of vier maal herhaal en gedoen op drie of vier verskillende dae. Alle data is statisties geanaliseer deur gebruik te maak van Graphpad Prism weergawe 5. Alle data is uitgedruk as gemiddeld±standaard fout van die gemiddeld (SEM). Waar twee groepe met mekaar vergelyk is, is die studente T-toets gebruik. In die geval van meervoudige vergelykings is eenrigting ANOVA met die Bonferroni toets gebruik. Verskille is as statisties beduidend geag indien die p-waarde laer as 0.05 is. Resultate: Die ATP toets het getoon dat SI wel ATP vlakke verlaag het in H9c2 selle (kontrole: 1.000 ± 0.000 Arbitrêre Eenhede (AE) vs SI: 0.597 ± 0.042 AE; n = 3; p < 0.001). SI het ook ‘n afname in ATP vlakke in MDA-MB-231 selle geïnduseer (kontrole: 1.000 ± 0.000 AE vs SI: 0.458 ± 0.025 AE; n = 4; p < 0.01). SI was egter nie geassosieer met ‘n toename in seldood in H9c2 en MDA-MB-231 selle nie, soos bepaal deur PI en JC-1 kleuring. SI het ook geen invloed op fosfatase aktiwiteit gehad in beide H9c2 en MDA-MB-231 selle nie, soos bepaal deur beide die pNPP en die DiFMUP toets. Die uitdrukking van PKB/Akt in MDA-MB-231 selle was wel beduidend laer na 2 ure van iskemie (kontrole: 1.000 ± 0.000 AE vs SI: 0.556 ± 0.027 AE; n = 3; p < 0.01). Tesame hiermee was daar ‘n beduidende toename in die uitdrukking van PP2Ac in die MDA-MB 231 selle in assosiasie met iskemie (kontrole: 1.482 x 107 ± 8.715 x 102 AE vs SI: 1.964 x 107 ± 1.406 x 106 AE; n = 3; p < 0.05) soos bepaal met ‘n studente T-toets. Behandeling met ‘n kombinasie van SI en middels (cantharidin en FTY 720) was geassosieer met ‘n afname in ATP vlakke in beide H9c2 en MDA-MB 231 selle. Daar was egter wel ‘n afname in die verbruik van ATP in H9c2 selle behandel met 5µM cantharidin onder SI kondisies, in vergelyking met die standaard SI-alleen behandeling. Behandeling met 1 µM FTY 720 het gelei na ‘n toename in PI fluorosensie, kenmerkend van nekrose, in normoksiese MDA-MB 231 selle (normoksie: 199.5 ± 8.381 relatiewe fluorosensie eenhede (RFE) vs normoksie + 1 µM FTY 720: 228.1 ± 2.902 RFE; n= 4; p < 0.05). 5 µM FTY 720 het egter verbasend geen effek ontlok nie. Data gegenereer deur die plaatleser het getoon dat 5µM cantharidin behandeling tesame met SI blootstelling mitochondriale funksie en integriteit verlaag het, soos bepaal deur JC-1 kleuring (SI: 1.000 ± 0.000 RFU vs 5µM cantharidin: 0.625 ± 0.112 RFU; n= 4; p < 0.01). Beeld analiese van die JC-1 kleuring in H9c2 selle het getoon dat SI + 5 µM cantharidin ook in hierdie seltipe mitochondriale funksie en integriteit verlaag het (SI: 1.000 ± 0.000 RFU vs SI + 5 µM cantharidin: 0.285 ± 0.059 RFU; n= 3; p < 0.01). Bespreking en gevolgtrekking: Twee ure van simuleerde iskemie het geen effek op fosfatase aktiwiteit in beide H9c2 en MDA-MB-231 selle gehad nie. SI was wel geassosieer met ‘n toename in die uitdrukking van PP2Ac in MDA-MB-231 selle, terwyl Akt/PKB afgeneem het. SI het soos verwag ‘n afname in ATP vlakke in beide H9c2 en MDA-MB-231 selle teweeg gebring. Ten spyte hiervan, het 2 ure van SI nie seldood veroorsaak nie, soos bepaal deur PI en JC-1 kleuring. Ander navorsers het getoon dat iskemie seldood kan induseer binne 6 tot 48 uur van inkubasie. Vorige studies in ons laboratorium het egter getoon dat 2 ure genoegsaam was om seldood te induseer in H9c2 selle, soos gemeet deur ‘n Anneksin/PI toets. Farmakologiese inhibisie van PP2A met 5µM cantharidin in kombinasie met SI het selle beskerm deur die verbruik van ATP in die H9c2 selle te beperk. Ander studies het getoon dat PP2A inhibisie inderdaad hartselle beskerm teen iskemie, terwyl studies in kanker gerapporteer het dat PP2A inhibisie seldood induseer. Dit was wel onverwags dat, ondanks die feit dat PP2A inhibisie ten tye van iskemie, deur die toediening van 5µM cantharidin, ATP verbruik beperk het in H9c2 selle, dit ook mitochondriale integriteit en funksie benadeel het, soos getoon deur JC-1 kleuring. SI + 5 µM cantharidin was ook geassosieer met ‘n afname in mitokondriale funksie en integriteit in MDA-MB-231 selle. Nieteenstaande, PP2A inhibisie in die hart is deur ander navorsers as beskermend getoon. Die aktivering van PP2A deur 1 µM FTY 720 in normoksiese MDA-MB-231 selle het nekrose veroorsaak soos getoon deur PI kleuring. Ander studies het ook getoon dat PP2A aktivering lei na seldood in kankerselle. Dit is dus ‘n tumor-onderdukker. Daar is egter ook toenemend bewyse dat PP2A inhibisie ook na seldood kan lei, wat dit dus impliseer as ‘n tumor-promotor in sekere tipes kanker. Die gevolgtrekking is dus dat PP2A moontlik ‘n tweevoudige rol in seldood speel, afhangend van die betrokke holo-ensiem, asook moontlik die seltipe. Meer studies moet gedoen word om die rol van PP2A in seldood in verskillende seltipes te ondersoek, asook om te bepaal watter holo-ensieme geteiken moet word om die gewenste uitkoms te bewerkstellig. PP2A bly relevant in die veld van navorsing aangaande kankerterapie, asook kardiobeskerming.

Please refer to this item in SUNScholar by using the following persistent URL: http://hdl.handle.net/10019.1/107880
This item appears in the following collections: