PCR-based DGGE typification of the microbial community in Kepi grains
Date
2003-12
Authors
Garbers, Ilze-Mari
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Kepi is a fermented milk beverage that originated in Eastern Europe. Traditional
Kepi is a lightly acidic, carbonated beverage, with a slight yeasty taste. The starter
used to produce this beverage is an irregularly shaped, yellowish-white grain-like
structure similar in appearance to a cauliflower floret. The characteristic flavour of
Kepi is produced by a complex spectrum of microbial species that include species
of yeasts, lactic acid bacteria, acetic acid bacteria and mycelial fungi. At the end
of the fermentation process the grainy starter can be recovered and re-used, since
the microbes can easily be recovered as a solid matrix.
The microbes comprising Kepi grains have only been identified using
classical identification techniques such as selective growth media, morphological,
physiological and biochemical characteristics. In this study, polymerase chain
reaction (PCR)-based denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis
was used to typify and identify the complex microbial consortium present in the
Kepi grains. A part of the 168 ribosomal RNA (rRNA) gene from the microbial
population in mass-cultured, traditionally cultured and Irish Kepi grains were
amplified using 'Eubacterial' specific primers and a part of the 268 rRNA gene was
amplified using yeast specific primers. The PCR fragments were resolved by
DGGE, resulting in unique fingerprints for the Eubacteria and yeasts present in the
different Kepi grain types. The traditionally cultured Kepi grains were found to
incorporate the most Eubacteria and yeast species, while the mass-cultured Kepi
grains contained the lowest number of Eubacteria and yeast species.
The different Eubacteria and yeast species were identified by cloning the
PCR products and sequencing the cloned inserts. The obtained DNA sequences
were compared to sequences available on the NCBI website. 8ix lactobacilli were
identified: Lb. crispatus (KC-4); three Lb. species (KC-36, KC-38 and KC-43); and
two unculturable lactobacilli (KC-2 and KC-3). The yeasts were identified as
Saccharomyces cerevisiae (KC-y18) and Candida lambica (KC-y1). Unidentified
isolates from kefiran strings that could not be identified using traditional methods
were also identified by cloning the PCR products and sequencing the cloned
inserts. The four isolates were identified as Lb. kefiri (KGI-A), Lb. parakefiri (KGIB),
Lb. gallina rum (KGI-D) and an unculturable Lactobacillus (KGI-5). The phylogenetic relationship between the identified lactobacilli and the
lactobacilli commonly found in Kepi grains was determined. The identified
lactobacilli were grouped together in a clade with a bootstrap support value of
84%. The clade also contained representatives of Lb. delbrueckii subsp. lactis,
Lb. acidophilus, Lb. gallinarum, Lb. helveticus, Lb. crispatus, Lb. species and
unculturable lactobacilli. The bands in the peR-based DGGE fingerprints of the
Eubacteria and the yeasts were identified, and a DGGE marker was subsequently
constructed for the rapid identification of the Eubacteria present in mass-cultured
Kepi grains.
The data obtained in this study clearly showed that Kepi grains that are
cultured differently, as well as Kepi grains from different origins have unique peRbased
DGGE banding patterns for both the Eubacteria and yeasts present in the
grains. The complex microbial consortium comprising Kepi grains could be
typified and identified using PeR-based DGGE, DNA cloning and sequencing.
The identification of the members of the microbial consortium is of importance for
the future commercialisation of the mass-cultured Kepi grains.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Kepi is 'n gefermenteerde melkdrankie wat sy oorsprong het in Oos Europa. Tradisionele Kepi is 'n effens suur, gekarboneerde drankie wat effens na gis smaak. Die beginkultuur wat gebruik word om dié drankie te maak is 'n oneweredige, geel-wit korrelagtige struktuur wat baie lyk soos 'n blomkoolkoppie. Die karakteristieke smaak van Kepi word geproduseer deur 'n komplekse spektrum mikrobiese spesies wat giste, melksuur- en asynsuurbakterieë en ~. misillêre fungi insluit. Aan die einde van die fermentasieproses kan die korrelagtige beginkultuur herwin word en weer gebruik word, aangesien die mikrobes maklik herwin kan word as 'n soliede matriks. Die mikrobes waaruit Kepikorrels bestaan, is nog slegs met behulp van klassieke identifikasiemetodes soos selektiewe groeimedia, morfologiese, fisiologiese and biochemiese eienskappe geïdentifiseer. In hierdie studie is polimerase kettingreaksie (PKR)-gebaseerde denaturerende gradiënt jelelektroforese (DGGE) analise gebruik om die komplekse mikrobiologiese konsortium in die Kepikorrels te tipeer en te identifiseer. 'n Gedeelte van die 16S ribosomale RNS (rRNS) geen van die mikrobiologiese populasie in massagekweekte, tradisioneel gekweekte en Ierse Kepikorrels is geamplifiseer met 'Eubakferiële' spesifieke peilers en In gedeelte van die 26S rRNS geen is geamplifiseer met gis spesifieke peilers. Die PKR fragmente is onderskei deur DGGE, wat unieke vingerafdrukke vir die Eubakteriële- en gisspesies in die verskillende Kepikorrel tipes gelewer het. Die tradisioneel gekweekte Kepikorrels het die meeste Eubakteriële- en gisspesies geïnkorporeer, terwyl die Ierse Kepikorrels die minste Eubakteriële- en gisspesies geïnkorporeer het. Die verskillende Eubakteriële- en gisspesies is geïdentifiseer deur klonering van die PKR produkte en deur die gekloneerde insetsels se volgordes te bepaal. Die ONS volgordes is dan vergelyk met volgordes wat op die NCSI webwerf beskikbaar is. Ses lactobacilli is geïdentifiseer: Lb. ctispetus (KC-4); drie Lb. spesies (KC-36, KC-38 en KC-43); en twee onkultiveerbare lactobacilli (KC-2 en KC-3). Die giste is geïdentifiseer as Saccharomyces cerevisiae (KC-y18) en Candida lambica (KC-y1). Ongeïdentifiseerde isolate van kefiranstringe is ook geïdentifiseer deur klonering van die PKR produkte en deur die gekloneerde insetsels se volgorde te bepaal. Dié vier isolate is geïdentifiseer as Lb. kefiri (KGIA), Lb. parakefiri (KGI-B), Lb. gallina rum (KGI-D) en 'n onkultiveerbare Lactobacillus (KGI-5). Die filogenetiese verwantskap is bepaal tussen die geïdentifiseerde lactobacilli en lactobacilli wat geredelik in Kepikorrels gevind word. Die geïdentifiseerde lactobacilli was saam in 'n groep gegroepeer met 'n bootstrap waarde van 84%. Die groep het ook verteenwoordigers van Lb. delbrueckii subsp. lactis, Lb. acidophilus, Lb. gallina rum, Lb. helveticus, Lb. crispatus, Lb. species en 'n onkultiveerbare laktobacilli ingesluit. Die bande in die PKR-gebaseerde DGGE vingerafdrukke van die Eubakterieë en die giste is geïdentifiseer, en 'n DGGE merker is gemaak vir die vinnige identifikasie van die Eubakterieë wat in die massagekweekte Kepikorrels teenwoordig is. Die data wat in die studie verkry, is wys duidelik dat Kepikorrels wat op verskillende maniere gekweek is, en wat verskillende oorspronge het, unieke PKR-gebaseerde DGGE bandpatrone het vir beide die Eubakterieë en giste wat in die korrels teenwoordig is. Die komplekse mikrobiologiese konsortium waaruit Kepikorrels bestaan kon getipeer en geïdentifiseer word deur PKR-gebaseerde DGGE, klonering van DNS en volgordebepaling. Die identifikasie van lede van die mikrobiologiese konsortium is belangrik vir die toekomstige kommersialisasie van die massagekweekte Kepikorrels.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Kepi is 'n gefermenteerde melkdrankie wat sy oorsprong het in Oos Europa. Tradisionele Kepi is 'n effens suur, gekarboneerde drankie wat effens na gis smaak. Die beginkultuur wat gebruik word om dié drankie te maak is 'n oneweredige, geel-wit korrelagtige struktuur wat baie lyk soos 'n blomkoolkoppie. Die karakteristieke smaak van Kepi word geproduseer deur 'n komplekse spektrum mikrobiese spesies wat giste, melksuur- en asynsuurbakterieë en ~. misillêre fungi insluit. Aan die einde van die fermentasieproses kan die korrelagtige beginkultuur herwin word en weer gebruik word, aangesien die mikrobes maklik herwin kan word as 'n soliede matriks. Die mikrobes waaruit Kepikorrels bestaan, is nog slegs met behulp van klassieke identifikasiemetodes soos selektiewe groeimedia, morfologiese, fisiologiese and biochemiese eienskappe geïdentifiseer. In hierdie studie is polimerase kettingreaksie (PKR)-gebaseerde denaturerende gradiënt jelelektroforese (DGGE) analise gebruik om die komplekse mikrobiologiese konsortium in die Kepikorrels te tipeer en te identifiseer. 'n Gedeelte van die 16S ribosomale RNS (rRNS) geen van die mikrobiologiese populasie in massagekweekte, tradisioneel gekweekte en Ierse Kepikorrels is geamplifiseer met 'Eubakferiële' spesifieke peilers en In gedeelte van die 26S rRNS geen is geamplifiseer met gis spesifieke peilers. Die PKR fragmente is onderskei deur DGGE, wat unieke vingerafdrukke vir die Eubakteriële- en gisspesies in die verskillende Kepikorrel tipes gelewer het. Die tradisioneel gekweekte Kepikorrels het die meeste Eubakteriële- en gisspesies geïnkorporeer, terwyl die Ierse Kepikorrels die minste Eubakteriële- en gisspesies geïnkorporeer het. Die verskillende Eubakteriële- en gisspesies is geïdentifiseer deur klonering van die PKR produkte en deur die gekloneerde insetsels se volgordes te bepaal. Die ONS volgordes is dan vergelyk met volgordes wat op die NCSI webwerf beskikbaar is. Ses lactobacilli is geïdentifiseer: Lb. ctispetus (KC-4); drie Lb. spesies (KC-36, KC-38 en KC-43); en twee onkultiveerbare lactobacilli (KC-2 en KC-3). Die giste is geïdentifiseer as Saccharomyces cerevisiae (KC-y18) en Candida lambica (KC-y1). Ongeïdentifiseerde isolate van kefiranstringe is ook geïdentifiseer deur klonering van die PKR produkte en deur die gekloneerde insetsels se volgorde te bepaal. Dié vier isolate is geïdentifiseer as Lb. kefiri (KGIA), Lb. parakefiri (KGI-B), Lb. gallina rum (KGI-D) en 'n onkultiveerbare Lactobacillus (KGI-5). Die filogenetiese verwantskap is bepaal tussen die geïdentifiseerde lactobacilli en lactobacilli wat geredelik in Kepikorrels gevind word. Die geïdentifiseerde lactobacilli was saam in 'n groep gegroepeer met 'n bootstrap waarde van 84%. Die groep het ook verteenwoordigers van Lb. delbrueckii subsp. lactis, Lb. acidophilus, Lb. gallina rum, Lb. helveticus, Lb. crispatus, Lb. species en 'n onkultiveerbare laktobacilli ingesluit. Die bande in die PKR-gebaseerde DGGE vingerafdrukke van die Eubakterieë en die giste is geïdentifiseer, en 'n DGGE merker is gemaak vir die vinnige identifikasie van die Eubakterieë wat in die massagekweekte Kepikorrels teenwoordig is. Die data wat in die studie verkry, is wys duidelik dat Kepikorrels wat op verskillende maniere gekweek is, en wat verskillende oorspronge het, unieke PKR-gebaseerde DGGE bandpatrone het vir beide die Eubakterieë en giste wat in die korrels teenwoordig is. Die komplekse mikrobiologiese konsortium waaruit Kepikorrels bestaan kon getipeer en geïdentifiseer word deur PKR-gebaseerde DGGE, klonering van DNS en volgordebepaling. Die identifikasie van lede van die mikrobiologiese konsortium is belangrik vir die toekomstige kommersialisasie van die massagekweekte Kepikorrels.
Description
Thesis (MSc Food Sc )--Stellenbsosch University, 2003.
Keywords
Grain -- Microbiology, Cultured milk, Kefir, Polymerase chain reaction, Gel electrophoresis, Dissertations -- Food science, Theses -- Food science