Design and fabrication of a label-free LC3 immunosensor towards the estimation of autophagy flux
Date
2021-03
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: n 2016 professor Yoshinori Oshumi proved that autophagy is dysfunctional in neu-
rodegenerative diseases such as Alzheimer’s, enhanced in various cancers and progressively
declining in ageing. Autophagy also relates to metabolic disorder, infectious and general
degenerative diseases, and is a critical factor in the development of diseases relating to an
increase in cancer risk. The ability to monitor autophagy has become key interest in the
bio-tech industry and is also an excellent indication of a person’s overall health, however
to monitor and determine autophagy flux remains a challenge.
LC3 protein is a proven biomarker that directly relates to the rate of autophagic ac-
tivity and accumulates as autophagosomes are formed. With an increase and decrease in
the rate of autophagy the concentration of LC3 levels will alternate and is an excellent
estimate towards determining autophagy flux.
For this project different biosensing techniques were explored for LC3 detection with
an electrochemical biosensor chosen to be most applicable due to its robustness and se-
lectivity towards proteins. The goal towards a proof of concept utilised commercially
manufactured carbon nanofibre screen printed electrodes by Dropsens that were modified
in development of an immunosensor. For antibody crosslinking, the sensors were electro-
grafted using a diazonium salt mixture to form carboxyl support groups followed by the
activation of these groups using EDC/NHS activation chemistry. The antibody bindings
were verified with fluorescent microscopy by attaching a secondary antibody. Square wave
voltammetry was use as method of detection due to its simplicity as well as the method
generating absolute data for comparison. All square wave voltammetry experiments were
executed in 5 mM ferricyanide redox couple.
The functionality of the sensors were tested by performing a full scale test over a wide
range of different protein concentrations. The work done was successful towards a proof
of concept sensor for LC3 detection, with an increase in protein bindings observed over
the tested range and space for optimisation to increase sensitivity and accuracy.
AFRIKAANSE OPSOMMING: In 2016 het professor Yoshinori Oshumi bewys dat autofagie disfunksioneel in neuro- degeneratiewe siektes is soos byvoorbeeld Alzheimer’s, versterk is in ’n verskeindenheid kankers en geleidelik afnemend in veroudering is. Autofagie het ook verband met metabo- liese agteruitgang en aansteeklik asook algehele degeneratiewe siektes, en speel ’n kritiese rol in die ontwikkeling van siektes wat in verband met kanker risiko is. Die bepaling en monitering van autofagie se aanvraag het vermeerder maar bly tans ’n groot uitdaging. LC3 proteïn is ’n bewysde biomerker vir autofagie en staan in direkte verband met autofagie vloed waar die versameling van die proteïn verwys na die ontwikkeling van ’n outofagosome. ’n Vermeerdering en vermindering in autofagie vloed sal ’n verhoging en verlaaging in LC3 voortbring. ’n Elektrochemiese biosensor was mees van toepasing op gevolg van die literatuur stu- die omdat dit robuust en selektief op proteïne is. Die hoof konsep begrip is bewys deur gebruik te maak van kommersiele vervaardigde koolstof nanovesel elektrodes en dit deur prosesse te plaas namens die ontwikkeling van ’n immunosensor. Vir teenligaampie kruis koppeling was die sensors ge-electrograft met ’n diazonium sout mengsel om karboksiele groepe te vorm en is geaktiveer deur gebruik te maak van EDC/NHS kruis koppeling chemie. Fluoresserende mikroskopie was gebruik om die bindings te verifieer deur ’n sekondˆere teenligaampie te bind. Blok golf voltammetrie was gebruik as die hoof metings metode en is uitgevoer in 5 mM ferricyanide. Die sensor se funksionaliteit was getoets deur ’n volskaalse toets uit te voer en sy werking oor a wye spektrum van konsentrasies se evalueer. Die ontwikkeling van ’n bewys van konsep begrip was suksesvol waar ’n vermeerdering in konsentrasie waargeneem is op die geproduseerde data, met baie spasie vir optimeering om die sensor se sensitiwiteit en akuraatheid te verbeter.
AFRIKAANSE OPSOMMING: In 2016 het professor Yoshinori Oshumi bewys dat autofagie disfunksioneel in neuro- degeneratiewe siektes is soos byvoorbeeld Alzheimer’s, versterk is in ’n verskeindenheid kankers en geleidelik afnemend in veroudering is. Autofagie het ook verband met metabo- liese agteruitgang en aansteeklik asook algehele degeneratiewe siektes, en speel ’n kritiese rol in die ontwikkeling van siektes wat in verband met kanker risiko is. Die bepaling en monitering van autofagie se aanvraag het vermeerder maar bly tans ’n groot uitdaging. LC3 proteïn is ’n bewysde biomerker vir autofagie en staan in direkte verband met autofagie vloed waar die versameling van die proteïn verwys na die ontwikkeling van ’n outofagosome. ’n Vermeerdering en vermindering in autofagie vloed sal ’n verhoging en verlaaging in LC3 voortbring. ’n Elektrochemiese biosensor was mees van toepasing op gevolg van die literatuur stu- die omdat dit robuust en selektief op proteïne is. Die hoof konsep begrip is bewys deur gebruik te maak van kommersiele vervaardigde koolstof nanovesel elektrodes en dit deur prosesse te plaas namens die ontwikkeling van ’n immunosensor. Vir teenligaampie kruis koppeling was die sensors ge-electrograft met ’n diazonium sout mengsel om karboksiele groepe te vorm en is geaktiveer deur gebruik te maak van EDC/NHS kruis koppeling chemie. Fluoresserende mikroskopie was gebruik om die bindings te verifieer deur ’n sekondˆere teenligaampie te bind. Blok golf voltammetrie was gebruik as die hoof metings metode en is uitgevoer in 5 mM ferricyanide. Die sensor se funksionaliteit was getoets deur ’n volskaalse toets uit te voer en sy werking oor a wye spektrum van konsentrasies se evalueer. Die ontwikkeling van ’n bewys van konsep begrip was suksesvol waar ’n vermeerdering in konsentrasie waargeneem is op die geproduseerde data, met baie spasie vir optimeering om die sensor se sensitiwiteit en akuraatheid te verbeter.
Description
Thesis (MEng)--Stellenbosch University, 2021.
Keywords
Immunosensor -- Design and Fabrication, UCTD, Degenerative diseases, Cancer -- Risk factors, Autophagy Flux, Biosensors