Identification of potential biomarkers of cardiotoxicity induced by doxorubicin therapy in a tumour bearing model by targeting specific micro-RNAs
Date
2021-03
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Introduction: Anthracycline-induced cardiotoxicity, a major side effect of chemotherapeutic drugs such as doxorubicin (DOX), has been a priority within the field of cardio-oncology for a number of decades. While multiple approaches and strategies have been utilized to understand and rectify this enigmatic condition, very little translatable research success has been achieved. Paramount to the reasons for this lack of utilizable return is that research has largely focused on the acute form of this disease, which is reversible, in contrast to the chronic form which has no cure. The majority of the tried and tested interventions have prioritized the oxidative stress theory, and the experimental models that have been developed have omitted the potential contributory effect of tumours within this context. Since their discovery, the elucidation of the primary roles of microRNAs (miRNAs) in the pathogenesis of oncological and non-oncological diseases has received much attention. As such, the detection of the existence of cell-free miRNAs in circulation has motivated researchers to investigate the role of these small evolutionary conserved endogenous single-stranded, non-coding RNAs as prospective non-invasive biomarkers. Therefore, this study explored the expression profile of a few miRNAs that have been observed in other pathologies that have the potential to be of significance in this context, by using a clinically relevant model that takes into account the plausible effects of tumour presence and the known DOX concomitant consequences.
Methods: Chronic DOX-induced cardiotoxicity was initiated through cumulative DOX injections (2.5 mg/kg/week) in 37 female Sprague-Dawley rats over the course of eight weeks. Prior to this, breast cancer mammary gland tumours were induced in these experimental animals through the injection of LA7 cells into the mammary fat pad following a carefully optimized protocol. Comparisons were carried out between groups that included a vehicle (control) (Hank’s balanced salt solution), tumour, DOX and a combination of the tumour and DOX-treatment. A week after the last DOX injection, animals were euthanized, blood was collected and the heart was excised for molecular and biochemical analysis. To detect early changes in miRNA profile expression, some animals were sacrificed after five weeks to represent early chronic modifications, whereas the rest of the experimental animals were sacrificed after nine weeks to represent late chronic adaptions. While miRNA manifestation was evaluated from plasma samples collected and assessed via quantitative PCR, the hallmarks of DOX-induced cardiotoxicity such as cardiac hypertrophy, fibrosis, oxidative stress and apoptosis were assessed via histological staining and western blotting techniques.
Results and Discussion: Mammary tumours were successfully induced and reached a peak volume (2563.00 ± 478.20 mm3) after two weeks of LA7 cell inoculation. It was also evident from these results that DOX is an effective chemotherapeutic agent for breast cancer; as tumour growth was significantly lower (1523.00 ± 457.80 mm3, p< 0.01) at this time point when compared to the tumour only group. Whilst miR-208a was significantly down-regulated in all treatment groups when compared to the vehicle (control) after eight weeks, plasma miR-29b expression was substantially upregulated across all groups after eight weeks versus the four week time point. This study observed no noteworthy changes in miRNA-133a and 133b following eight weeks of treatment. Together, these results, in amalgamation with increased collagen deposition (306.90 ± 52.62%, p < 0.01) vs control (100.00 ± 6.35%), cleaved caspase-7 (844.10 ± 166.21%, p <0.05) vs control (100.00 ± 3.40%) and MLC-2v (406.90± 47.18%, p < 0.01) vs control (100.00 ± 3.12%), in the combination group, demonstrated that miR-208a exhibits potential as a non-invasive biomarker of late chronic myocardial toxicity linked to fibrosis, apoptosis and cardiac hypertrophy, respectively. miR-208a and miR-133a remain the only miRNAs in this context that may have the potential to be utilized as early chronic biomarkers of cardiotoxicity in the presence of a tumour, however further investigations are warranted.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Uittreksel: Inleiding: Antrasiklien-geïnduseerde kardiotoksisieit, ‘n hoof newe-effek van chemoterapeutiese middels soos doksorubisien (DOX), is reeds vir dekades die prioriteit in die kardio-onkologiese veld. Terwyl daar verskeie benaderings en strategieë aangewend word om hierdie enigmatiese toestand te gebruik en te verstaan, is weinig verstaanbare navorsingsukses bereik. Die hoofredes vir die onsuksesvolle uitkoms is die fokus op navorsing van die akute vorm, wat omkeerbaar is, van hierdie siekte, eerder as die chroniese vorm, wat nie omkeerbaar is. Die meerderheid van die intervensies wat gedoen en getoets is, het op die oksidatiewe stres teorie berus, en die eksperimentele modelle wat ontwikkel is, het die potensiële bydraende effek van tumore binne hierdie konteks, weggelaat. Sedert hul ontdekking, het die primêre rolle van mikroRNAs (miRNAs) in die patogenese van onkologiese en nie-onkologiese siektes baie aandag verkry. Na die ondekking van selvrye miRNAs in die sirkulasie, het dit navorsers gemotiveer om die rol van hierdie klein evolusionêr gekonserveerde endogene enklestring, nie-gekodeerde RNA as potensiële, nie-ingrypende biomerkers te ondersoek. Daarom het hierdie studie die uitdrukkingsprofiele van ‘n paar miRNAs, wat in ander patologieë waargeneem is en moontlik relevant kan wees in hierdie konteks, deur gebruik te maak van ‘n klinies relevante model wat die waarskynlike effekte van die teenwoordigheid van ‘n tumor en die bekende DOX verwante gevolge in ag neem. Metodes: Chroniese DOX-geinduseerde kardiotoksisiteit is in 37 vroulike Sprague Dawley rotte oor ‘n periode van agte weke geinisiëer deur middel van kumulatiewe DOX inspuitings (2.5 mg/kg/week). Voor dit, is borskanker borskliertumore in hierdie eksperimentele diere geinduseer deur LA7 selle in die borsvetarea in te spuit na ‘n optimaliserings protokol gevolg is. Tussengroep vergelykings is uitgevoer wat ‘n draergroep (kontrole) (Hank’s gebalanseerde soutoplossing), tumor, DOX en ‘n kombinasie van die tumor en DOX-behandeling ingesluit het. ‘n Week na die finale DOX inspuiting is die diere dood gemaak, bloed was versamel en die hart is gedissekteer vir molekulêre en biochemiese analises. Sommige diere is na vyf weke dood gemaak sodat vroeë veranderinge in die miRNA profiel uitdrukking ontleed kon word om vroeë chroniese veranderinge te simuleer, terwyl die oorblywende eksperimentele diere na nege weke dood gemaak is om latere chroniese aanpassings te simuleer. miRNA manifestering is deur middel van plasma monsters verkry en deur kwantitatiewe PKR ontleed, en die kenmerkende DOX-geinduseerde kardiotoksisiteit soos bv. kardiale hipertrofie, fibrose, oksidatiewe stres en apoptose, is deur middel van histologiese kleurings, gical kleuring en westerse blattering tegnieke ondersoek. Resultate en Bespreking: Borstumore is suksesvol verkry na selinokulasie met LA7, en na twee weke is piekvolume bereik (2563.00 ± 478.20 mm3). Dit is verder bevestig dat DOX ‘n effektiewe chemoterapeutiese middel vir borskanker is; omrede die tumorgroei betekenisvol laer was (1523.00 ± 457.80 mm3, p< 0.01) by hierdie tydsinterval, vergeleke met die tumorgroep. Terwyl miR-208a betekenisvol afgereguleer was in alle groepe, vergeleke met die draer (kontrole) groep na agt weke, het plasma miR-29b uitdrukking aansienlik verhoog oor alle groepe na agt weke vergeleke met die vier-week periode. Hierdie studie rapporteur geen beduidende veranderinge in miRNA-133a en 133b na ‘n agt weke behandeling nie. Gesamentlik demonstreer die resultate, tesame met verhoogde kollageen-neerlegging (306.90 ± 52.62%, p < 0.01) vs kontrole (100.00 ± 6.35%), gesplyte kaspase -7 (844.10 ± 166.21%, p <0.05) vs kontrole (100.00 ± 3.40%) en MLC-2v (406.90± 47.18%, p < 0.01) vs kontrole (100.00 ± 3.12%), in die gekombineerde groep, dat miR-208a potensiaal as ‘n nie-ingrypende biomarkers van latere chroniese miokardiale toksistiteit, wat gekoppel is met fibrose, apoptose en kardiale hpertrofie, vertoon. miR-208a en miR-133a is die enigste miRNAs in hierdie konteks wat potensiaal toon as vroeë chroniese biomerkers van kardiotoksisiteit in die teenwoordigheid van ‘n tumor, maar verdere ondersoeke word aanbeveel.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Uittreksel: Inleiding: Antrasiklien-geïnduseerde kardiotoksisieit, ‘n hoof newe-effek van chemoterapeutiese middels soos doksorubisien (DOX), is reeds vir dekades die prioriteit in die kardio-onkologiese veld. Terwyl daar verskeie benaderings en strategieë aangewend word om hierdie enigmatiese toestand te gebruik en te verstaan, is weinig verstaanbare navorsingsukses bereik. Die hoofredes vir die onsuksesvolle uitkoms is die fokus op navorsing van die akute vorm, wat omkeerbaar is, van hierdie siekte, eerder as die chroniese vorm, wat nie omkeerbaar is. Die meerderheid van die intervensies wat gedoen en getoets is, het op die oksidatiewe stres teorie berus, en die eksperimentele modelle wat ontwikkel is, het die potensiële bydraende effek van tumore binne hierdie konteks, weggelaat. Sedert hul ontdekking, het die primêre rolle van mikroRNAs (miRNAs) in die patogenese van onkologiese en nie-onkologiese siektes baie aandag verkry. Na die ondekking van selvrye miRNAs in die sirkulasie, het dit navorsers gemotiveer om die rol van hierdie klein evolusionêr gekonserveerde endogene enklestring, nie-gekodeerde RNA as potensiële, nie-ingrypende biomerkers te ondersoek. Daarom het hierdie studie die uitdrukkingsprofiele van ‘n paar miRNAs, wat in ander patologieë waargeneem is en moontlik relevant kan wees in hierdie konteks, deur gebruik te maak van ‘n klinies relevante model wat die waarskynlike effekte van die teenwoordigheid van ‘n tumor en die bekende DOX verwante gevolge in ag neem. Metodes: Chroniese DOX-geinduseerde kardiotoksisiteit is in 37 vroulike Sprague Dawley rotte oor ‘n periode van agte weke geinisiëer deur middel van kumulatiewe DOX inspuitings (2.5 mg/kg/week). Voor dit, is borskanker borskliertumore in hierdie eksperimentele diere geinduseer deur LA7 selle in die borsvetarea in te spuit na ‘n optimaliserings protokol gevolg is. Tussengroep vergelykings is uitgevoer wat ‘n draergroep (kontrole) (Hank’s gebalanseerde soutoplossing), tumor, DOX en ‘n kombinasie van die tumor en DOX-behandeling ingesluit het. ‘n Week na die finale DOX inspuiting is die diere dood gemaak, bloed was versamel en die hart is gedissekteer vir molekulêre en biochemiese analises. Sommige diere is na vyf weke dood gemaak sodat vroeë veranderinge in die miRNA profiel uitdrukking ontleed kon word om vroeë chroniese veranderinge te simuleer, terwyl die oorblywende eksperimentele diere na nege weke dood gemaak is om latere chroniese aanpassings te simuleer. miRNA manifestering is deur middel van plasma monsters verkry en deur kwantitatiewe PKR ontleed, en die kenmerkende DOX-geinduseerde kardiotoksisiteit soos bv. kardiale hipertrofie, fibrose, oksidatiewe stres en apoptose, is deur middel van histologiese kleurings, gical kleuring en westerse blattering tegnieke ondersoek. Resultate en Bespreking: Borstumore is suksesvol verkry na selinokulasie met LA7, en na twee weke is piekvolume bereik (2563.00 ± 478.20 mm3). Dit is verder bevestig dat DOX ‘n effektiewe chemoterapeutiese middel vir borskanker is; omrede die tumorgroei betekenisvol laer was (1523.00 ± 457.80 mm3, p< 0.01) by hierdie tydsinterval, vergeleke met die tumorgroep. Terwyl miR-208a betekenisvol afgereguleer was in alle groepe, vergeleke met die draer (kontrole) groep na agt weke, het plasma miR-29b uitdrukking aansienlik verhoog oor alle groepe na agt weke vergeleke met die vier-week periode. Hierdie studie rapporteur geen beduidende veranderinge in miRNA-133a en 133b na ‘n agt weke behandeling nie. Gesamentlik demonstreer die resultate, tesame met verhoogde kollageen-neerlegging (306.90 ± 52.62%, p < 0.01) vs kontrole (100.00 ± 6.35%), gesplyte kaspase -7 (844.10 ± 166.21%, p <0.05) vs kontrole (100.00 ± 3.40%) en MLC-2v (406.90± 47.18%, p < 0.01) vs kontrole (100.00 ± 3.12%), in die gekombineerde groep, dat miR-208a potensiaal as ‘n nie-ingrypende biomarkers van latere chroniese miokardiale toksistiteit, wat gekoppel is met fibrose, apoptose en kardiale hpertrofie, vertoon. miR-208a en miR-133a is die enigste miRNAs in hierdie konteks wat potensiaal toon as vroeë chroniese biomerkers van kardiotoksisiteit in die teenwoordigheid van ‘n tumor, maar verdere ondersoeke word aanbeveel.
Description
Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2021.
Keywords
Cardiotoxicity, MicroRNA -- Analysis, Doxorubicin -- Therapeutic use, Cardiovascular disease, Cancer, Tumors in animals, UCTD