Design of a serum amyloid A proof-of-concept biosensor for detection of inflammation
Date
2021-03
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Globally, there is a medical focus shift from communicable diseases to non-communicable diseases (NCD). Due to its critical role in the disease’s response to and cost of treatment, a great need for the early diagnosis of NCDs has arisen. An inflammatory proof-of-concept biosensor was designed for early cancer detection in motion.
The piece-wise developed proof-of concept biosensor, which was built in-house, consists of an impedance analyser, data processor, biosensor and signal amplifier. The biomarker that was identified was serum amyloid A (SAA).
The impedance analyser makes use of an impedance analysing IC chip, AD5933, with additional analog front-end circuitry to measure the impedance of the device under tests (DUTs) and addresses the inherent shortcomings of the AD5933. The frequency range was extended to cover a range from 10 Hz to 100 kHz, by using an external programmable oscillator. The impedance range was increased by using a multiplexer and four different calibration resistors (33 Ω, 3, 33 and 330 kΩ) enabling the system to measure an impedance range from 200 Ω to 1.9 MΩ.
The system was tested with DUTs that were developed to model the equivalent circuit of a non-Faradaic biosensor, as found in literature. Within its operating frequency range (10 Hz to 100 kHz) and impedance range, the system achieved a percentage error below 4% for the measured impedance values. The phase percentage error was below 4% for frequency interval from 1 to 100 kHz, but increased at lower frequency intervals. The higher phase error at lower frequencies can be ascribed to spectral leakage, which occurs due to the clock divider of the programmable oscillator.
The biosensor was developed by immobilising SAA antibodies onto the surface of the interdigitated gold electrodes. The antibodies were immobilised using the established NHS/EDC protocol for the coupling of NH2 and COOH. The successful immobalisation of antibodies was verified by confocal microscopy, but the orientation could not be confirmed with the microscopy imaging. Antiboeds were successfully immobilised onto gold nanoparticles and were also verified by confocal microscopy.
The biosensors developed in 2019 could accurately detect and discern the presence and concentration of SAA respectively. A calibration curve was calculated using only two concentrations of SAA: 10 µg/mL and 100 µg/mL. Testing of other concentrations will improve the accuracy of the calibration curve. The sensors developed in 2020 could, unfortunately, not be used as the electrodes had manufacturing flaws.
The amplification step entailed using antibody-conjugated gold nanoparticles (Ab-AuNPs). The antibodies were immobilised using the NHS/EDC protocol and the immobilisation was verified using confocal imaging. The signal after inclubating the Ab-AuNPs onto the electrode did not result in detectable amplification.
The outcomes of this research project are preliminary steps towards an inflammatory sensing system. This system could guide medical practitioners in prescribing targeted intervention and provide care-givers with the necessary information to monitor their patients’ inflammatory states. The detection of inflammation will assist the early diagnosis of inflammatory diseases such as cancer, diabetes and other cardiovascular diseases. This could avert severe morbidity and mortality.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Wêreldwyd is daar ‘n mediese fokusverskuiwing van oordraagbare siektes na nie-oordraagbare siektes (NOSs). ‘n Groot behoefte aan die vroeë diagnose van NOSs het ontstaan omdat dit ‘n noodsaaklike rol kan speel op die reaksie en koste van behandeling van hierdie tipe siektes. ‘n Bewys-van-konsep (BVK) biosensor is gedeeltelik ontwerp, ontwikkel en getoets om die ontwikkeling van ‘n sorgvuldige inflammatoriese biosensor vir vroeë opsporing van kanker te inisieer. Die stuksgewys ontwikkelde BVK biosensor, wat intern gebou is, bestaan uit ‘n impedansie-ontleder, dataverwerker, biosensor en seinversterker. Die biomarker wat geïdentifiseer is, was serumamïloied A (SAA). Die impedansie-ontleder maak gebruik van ‘n impedansie-ansliserende geïntegreerde stroombaan, AD5933, met addisionele stroombane om die impedansie van die toestel onder toetse (TOTe) te meet. Die addisionele stroombaan spreek die inherente tekortkominge van die AD5933 aan. Die frekwensiereeks is uitgebrei om ‘n reeks van 10 Hz tot 100 kHz te dek deur ‘n eksterne programmeerbare ossilator te gebruik. Die impedansiereeks is verhoog deur die gebruik van ‘n vier-rigting skakelaar en vier verskillende kalibrasieweerstande (33 Ω, 3, 33 en 330 kΩ) te gebruik, wat die stelsel in staat stel om ‘n reeks van 200 Ω tot 1.9 MΩ te meet. Die stelsel is getoets met TOTe wat ontwikkel is om die ekwivalente stroombaan van ‘n nie-Faradïese biosensor te modelleer, soos aangetref in die literatuur. Binne sy werkfrekwensiereeks (10 Hz tot 100 kHz) en die impedansiereeks, het die stelsel ‘n persentasiefout onder 4% vir die gemete impedansie waardes behaal. Die fase presentasiefout was onder 4% vir die frekwensie interval tussen 1 en 100 kHz, maar het toegeneem met laer frekwensie intervalle. Hierdie toename kan toegeskryf word aan spektrale lekkasie, wat voorkom as gevolg van die klokverdeler van die programmerbare ossilator. Die biosensor is ontwikkel deur SAA-teenliggaampies op die oppervlak van die geïntegreerde goue elektrode te immobiliseer. Die teenliggaampies is geïmmobiliseer met behulp van die gevestigde NHS/EDC-protokol vir die koppeling van NH2 en COOH. Die suksesvolle immobilisering van teenliggaampies is deur konfokale mikroskopie bevestig, maar die oriëntasie kon nie so bevestig word nie. Die biosensors wat in 2019 ontwikkel is kon die teenwoordigheid en konsentrasie van SAA akkuraat opspoor en onderskei. ‘n Kalibrasiekurwe is bereken deur slegs twee konsentrasies SAA te gebruik: 10 µg/mL en 100 µg/mL. Die toets van ander konsentrasies sal die akkuraatheid van die kalibrasiekurwe verbeter. Weens vervaardigingsfoute is die sensors, wat in 2020 ontwikkel is, ongelukkig nie bruikbaar nie. Die seinversterking-stap behels die gebruik van teenliggaampies gebind aan boue nanodeeltjies (Ab-AuNP’s). Die teenliggaampies is geïmmobiliseer deur middle van ‘n NHS/EDC-protokol en die immobilisasie is met behulp van konfokale mikroskopie bevestig. Die sein na Ab-AuNPs inkubasie het nie opspoorbare versterking getoon nie. Die uitkomste van hierdie navorsingprojek is die beginstappe na ‘n inflammatoriese waarnemingstelsel. Dit kan mediese praktiseerders help in die voorskryf van doelgerigte intervensie en versorgers die nodige inligting bied om die inflammatoriese toestande van hul pasiënte te monitor. Die opsporing van ontsteking sal help met die vroeë diagnose van ontstekingsiektes soos kanker, diabetes en ander kardiovaskulêre siektes, wat ernstige siektes en sterftes kan voorkom.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Wêreldwyd is daar ‘n mediese fokusverskuiwing van oordraagbare siektes na nie-oordraagbare siektes (NOSs). ‘n Groot behoefte aan die vroeë diagnose van NOSs het ontstaan omdat dit ‘n noodsaaklike rol kan speel op die reaksie en koste van behandeling van hierdie tipe siektes. ‘n Bewys-van-konsep (BVK) biosensor is gedeeltelik ontwerp, ontwikkel en getoets om die ontwikkeling van ‘n sorgvuldige inflammatoriese biosensor vir vroeë opsporing van kanker te inisieer. Die stuksgewys ontwikkelde BVK biosensor, wat intern gebou is, bestaan uit ‘n impedansie-ontleder, dataverwerker, biosensor en seinversterker. Die biomarker wat geïdentifiseer is, was serumamïloied A (SAA). Die impedansie-ontleder maak gebruik van ‘n impedansie-ansliserende geïntegreerde stroombaan, AD5933, met addisionele stroombane om die impedansie van die toestel onder toetse (TOTe) te meet. Die addisionele stroombaan spreek die inherente tekortkominge van die AD5933 aan. Die frekwensiereeks is uitgebrei om ‘n reeks van 10 Hz tot 100 kHz te dek deur ‘n eksterne programmeerbare ossilator te gebruik. Die impedansiereeks is verhoog deur die gebruik van ‘n vier-rigting skakelaar en vier verskillende kalibrasieweerstande (33 Ω, 3, 33 en 330 kΩ) te gebruik, wat die stelsel in staat stel om ‘n reeks van 200 Ω tot 1.9 MΩ te meet. Die stelsel is getoets met TOTe wat ontwikkel is om die ekwivalente stroombaan van ‘n nie-Faradïese biosensor te modelleer, soos aangetref in die literatuur. Binne sy werkfrekwensiereeks (10 Hz tot 100 kHz) en die impedansiereeks, het die stelsel ‘n persentasiefout onder 4% vir die gemete impedansie waardes behaal. Die fase presentasiefout was onder 4% vir die frekwensie interval tussen 1 en 100 kHz, maar het toegeneem met laer frekwensie intervalle. Hierdie toename kan toegeskryf word aan spektrale lekkasie, wat voorkom as gevolg van die klokverdeler van die programmerbare ossilator. Die biosensor is ontwikkel deur SAA-teenliggaampies op die oppervlak van die geïntegreerde goue elektrode te immobiliseer. Die teenliggaampies is geïmmobiliseer met behulp van die gevestigde NHS/EDC-protokol vir die koppeling van NH2 en COOH. Die suksesvolle immobilisering van teenliggaampies is deur konfokale mikroskopie bevestig, maar die oriëntasie kon nie so bevestig word nie. Die biosensors wat in 2019 ontwikkel is kon die teenwoordigheid en konsentrasie van SAA akkuraat opspoor en onderskei. ‘n Kalibrasiekurwe is bereken deur slegs twee konsentrasies SAA te gebruik: 10 µg/mL en 100 µg/mL. Die toets van ander konsentrasies sal die akkuraatheid van die kalibrasiekurwe verbeter. Weens vervaardigingsfoute is die sensors, wat in 2020 ontwikkel is, ongelukkig nie bruikbaar nie. Die seinversterking-stap behels die gebruik van teenliggaampies gebind aan boue nanodeeltjies (Ab-AuNP’s). Die teenliggaampies is geïmmobiliseer deur middle van ‘n NHS/EDC-protokol en die immobilisasie is met behulp van konfokale mikroskopie bevestig. Die sein na Ab-AuNPs inkubasie het nie opspoorbare versterking getoon nie. Die uitkomste van hierdie navorsingprojek is die beginstappe na ‘n inflammatoriese waarnemingstelsel. Dit kan mediese praktiseerders help in die voorskryf van doelgerigte intervensie en versorgers die nodige inligting bied om die inflammatoriese toestande van hul pasiënte te monitor. Die opsporing van ontsteking sal help met die vroeë diagnose van ontstekingsiektes soos kanker, diabetes en ander kardiovaskulêre siektes, wat ernstige siektes en sterftes kan voorkom.
Description
Thesis (MEng)--Stellenbosch University, 2021.
Keywords
Inflammation, Serum -- Amyloid, Biosensors, Biological detectors, UCTD