Mapping of dwarf growth habit traits in apple (Malus pumila Mill.) using molecular markers and transcriptomics approaches
Date
2020-03
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Apple (Malus pumila Mill.) is one of the most important deciduous fruit crops
worldwide. Apples are traditionally valued as an important dietary source
of fibre and are high in antioxidants, contributing to human nutrition. In South
Africa, the apple industry plays a vital role in the country's agricultural economy due to
global exports. In recent years, more emphasis has been directed to dwarf trees,
as they are well suited for profitable high-density orchards and
sustainability of fruit production. However, dwarfism cannot always be linked to increased yield.
At Bien Donné Research Farm of the Agricultural Research Council (ARC)
Infruitec-Nietvoorbij’, several dwarf growth habits exist, which is related to a form of hybrid
incompatibility, hybrid necrosis. One of them is associated with undesirable characteristics
such as crinkled leaves and poor growth. Expression of hybrid necrosis in plants can lead to
a significant reduction in productivity, due to the deleterious epistatic interactions between
alleles that arose from divergent genetic backgrounds. Few, if any, genetic studies have thus far
investigated crinkle dwarf growth traits in apple. This study aimed to examine the genetic basis
underlying the crinkle dwarf phenotype by employing multidisciplinary approaches that
included segregation pattern studies, assessment of self-incompatibility (hybrid
incompatibility), molecular mapping and transcriptomic profiling of pooled samples of apical buds
and young leaves from normal and from crinkle dwarf phenotypes.
The genetics behind the crinkle dwarf trait was undertaken by studying the segregation patterns of
the first filial generation (F1) apple progenies, where parental combinations were
heterozygous. Segregation ratios of 9:7 and 3:1 were observed, for which crinkled dwarf
phenotypes is expressed when one of the two genes is homozygous recessive (D-ee or ddE-).
Additionally, the involvement of self-incompatibility (S) was investigated by identifying the
parental S-genotypes using PCR based consensus and allele-specific primers of the apple
S-RNAse gene. Eight parental S-genotypes were determined. Herein, the S-genotypes of Malling 1
(‘M.1’) (S3S9) and TSR1T187 (S7S24) were deduced
for the first time.
High-density SNP-based parental genetic linkage maps of ‘McIntosh’ and ‘M.1’
were constructed using the apple 20K Infinium SNP array. The crinkle dwarf trait was mapped on
linkage group (LG) 8 in ‘McIntosh’ and on LG2 in ‘M.1’. In the consensus genetic map, crinkle dwarf
trait also mapped on LG8. Additionally, the crinkle dwarf trait obtained for the
parental genetic maps were validated using Kruskal-Wallis (KW) analysis.
To gain deeper insights into the genes regulating crinkle dwarf phenotype, transcriptome
profiles of pooled meristematic tissues of normal and crinkle dwarf phenotypes were generated using
RNA-sequencing technology. A total of 921 significantly differentially expressed genes (DEGs), with
763 up-regulated and 158 down-regulated transcripts, were identified. Gene expression
analyses revealed that defense signaling and stress-related genes were up-regulated during
the expression of crinkle dwarf phenotype along with the activation of several antioxidant
proteins/enzymes. The high expression of lactoperoxidase (Class III peroxidase) together
with glutathione S-transferase suggests the involvement of reactive oxygen species (ROS). Genes
typically encoding for pathogenesis-related proteins (chitinase and pectin), antioxidant
enzymes, receptor-like protein (protein serine/threonine phosphatase), as well as
alpha-linolenic acid, a precursor of the phytohormone jasmonic acid were all up-regulated during
expression of crinkle dwarf phenotype. These findings support the notion that crinkle
dwarf phenotype does indeed exhibit hybrid necrosis symptoms. Consequently, an autoimmune response
might have been triggered by the allele incompatibilities, in this case between ‘McIntosh’ and
‘M.1’.
Overall, the information generated in this study will aid in designing an in-house
screening system for eliminating seedlings carrying crinkle dwarf genes from the ARC
breeding material. In future, these findings will also aid in the design of crosses with
predictable outcomes and in broadening a sustainable genetic base of the apple cultivars for high
productivity orchards, while avoiding raising
seedlings with dwarf growth habit associated with crinkled leaves.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Appel (Malus pumila Mill.) is een van die belangrikste sagtevrugtegewasse wêreldwyd. Appels word tradisioneel as 'n belangrike voedingsbron beskou en bevat baie antioksidante wat bydra tot menslike voeding. In Suid-Afrika speel die appelbedryf 'n belangrike rol in die land se landbou- ekonomie as gevolg van wêreldwye uitvoere. In die afgelope paar jaar is meer klem gelê op dwergbome, aangesien dit geskik is vir winsgewende, hoë-digtheid boorde met 'n volhoubare vrugteproduksie. Dwergbome kan egter nie altyd gekoppel word aan verhoogde opbrengste nie. Op die Bien Donné-navorsingsplaas van die Landbounavorsingsraad (LNR) Infruitec- Nietvoorbij, bestaan verskeie dwerggroeiwyses wat verband hou met 'n vorm van hibriede onverenigbaarheid, hibriede nekrose. Een daarvan hou verband met ongewenste eienskappe soos gekreukelde blare en swak groei. Uitdrukking van hibriede nekrose in plante kan lei tot 'n beduidende afname in produktiwiteit as gevolg van die nadelige epistatiese interaksies tussen allele wat voortspruit uit uiteenlopende genetiese agtergronde. Min, indien enige, genetiese studies het tot dusver ondersoek ingestel na die gekreukelde dwerggroei-eienskappe by appels. Hierdie studie het ten doel gehad om die genetiese basis onderliggend aan die gekreukelde dwergfenotipe te ondersoek deur gebruik te maak van multidissiplinêre benaderings wat insluit die studie van segregasiepatrone, assessering van self- onverenigbaarheid (hibriede onverenigbaarheid), molekulêre kartering en transkriptomiese profilering van saamgestelde monsters van apikale knoppe en jong blare van normale en gekreukelde dwergfenotipes. Die genetika onderliggend aan die gekreukelde dwerg eienskap is ondersoek deur die segregasiepatrone van die eerste filiale generasie (F1) nageslag te bestudeer, waar ouerkombinasies heterosigoties was. Segregasieverhoudings van 9:7 en 3:1 is waargeneem waar gekreukelde dwergfenotipes uitgedruk word wanneer een van die twee gene homosigoties resessief is (D-ee of ddE). Verder is die betrokkenheid van self-onverenigbaarheid (S) ondersoek deur die ouerlike S-genotipes, met behulp van PKR-gebaseerde konsensus en alleelspesifieke inleiers van die appel S-RNAse geen, te identifiseer. Agt ouerlike S-genotipes is bepaal. Die S-genotipes van Malling 1 ('M.1') (S3S9) en TSR1T187 (S7S24) is vir die eerste keer in hierdie studie bepaal. Hoë-digtheid SNP-gebaseerde ouer genetiese koppelingskaarte van 'McIntosh' en 'M.1' is saamgestel met behulp van die appel 20K Infinium “SNP-array”. Die gekreukelde dwerg eienskap is gekarteer op die koppelingsgroep (“linkage group”, LG) 8 in 'McIntosh' en op LG2 in 'M.1'. Op die konsensus genetiese kaart word gekreukelde dwerg eienskap ook op LG8 gekarteer. Die gekreukelde dwerg eienskap wat verkry is vir die ouerlike genetiese kaarte is ook bevestig met behulp van Kruskal- Wallis (KW) analise. Om dieper insigte te verkry in die gene wat die gekreukelde dwergfenotipe reguleer, is transkriptoom profiele van saamgevoegde meristematiese weefsels van normale en gekreukelde dwergfenotipes gegenereer met behulp van RNA-opeenvolgingstegnologie. 'n Totaal van 921 gene wat betekenisvol differensieel uitgedruk word (“differentially expressed genes”, DEG's), met 763 op- gereguleerde en 158 af-gereguleerde transkripte, is geïdentifiseer. Hierdie geen uitdrukkings analises het aan die lig gebring dat die verdedigings en stresverwante gene tydens die uitdrukking van 'n gekreukelde dwergfenotipe op-gereguleer is, tesame met die aktivering van verskeie antioksidantproteïene / ensieme. Die hoë uitdrukking van laktoperoksidase (Klas III peroksidase), tesame met “glutathion S-transferase” dui op die betrokkenheid van reaktiewe suurstofspesies (“reactive oxygen species “, ROS). Gene wat vir patogeenverwante proteïene (chitinase en pektien), antioksidantensieme, reseptoragtige proteïene (proteïne serien / treonien fosfatase) kodeer, asook alfa- linoleensuur, 'n voorloper van die fitohormoon jasmonsuur, is almal tydens die uitdrukking van die gekreukelde dwergfenotipe op-gereguleer. Hierdie bevindings ondersteun die gedagte dat die gekreukelde dwergfenotipe wel hibriede nekrose simptome vertoon. 'n Outo-immuunrespons kon gevolglike veroorsaak geword het deur alleelonverenigbaarheid, in hierdie geval tussen 'McIntosh' en 'M.1'. Gevolglik sal die inligting wat in hierdie studie gegenereer is, help om 'n interne siftingstelsel daar te stel om saailinge wat gekreukelde dwerggene het, te elimineer uit die LNR-teelmateriaal. In die toekoms sal hierdie bevindinge ook help met die samestelling van kruisings met voorspelbare uitkomste en die daarstel van 'n volhoubare genetiese basis van appelkultivars, vir boorde met 'n hoë produktiwiteit, terwyl die dwerggroeiwyse verbonde aan gekreukelde blare vermy word.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Appel (Malus pumila Mill.) is een van die belangrikste sagtevrugtegewasse wêreldwyd. Appels word tradisioneel as 'n belangrike voedingsbron beskou en bevat baie antioksidante wat bydra tot menslike voeding. In Suid-Afrika speel die appelbedryf 'n belangrike rol in die land se landbou- ekonomie as gevolg van wêreldwye uitvoere. In die afgelope paar jaar is meer klem gelê op dwergbome, aangesien dit geskik is vir winsgewende, hoë-digtheid boorde met 'n volhoubare vrugteproduksie. Dwergbome kan egter nie altyd gekoppel word aan verhoogde opbrengste nie. Op die Bien Donné-navorsingsplaas van die Landbounavorsingsraad (LNR) Infruitec- Nietvoorbij, bestaan verskeie dwerggroeiwyses wat verband hou met 'n vorm van hibriede onverenigbaarheid, hibriede nekrose. Een daarvan hou verband met ongewenste eienskappe soos gekreukelde blare en swak groei. Uitdrukking van hibriede nekrose in plante kan lei tot 'n beduidende afname in produktiwiteit as gevolg van die nadelige epistatiese interaksies tussen allele wat voortspruit uit uiteenlopende genetiese agtergronde. Min, indien enige, genetiese studies het tot dusver ondersoek ingestel na die gekreukelde dwerggroei-eienskappe by appels. Hierdie studie het ten doel gehad om die genetiese basis onderliggend aan die gekreukelde dwergfenotipe te ondersoek deur gebruik te maak van multidissiplinêre benaderings wat insluit die studie van segregasiepatrone, assessering van self- onverenigbaarheid (hibriede onverenigbaarheid), molekulêre kartering en transkriptomiese profilering van saamgestelde monsters van apikale knoppe en jong blare van normale en gekreukelde dwergfenotipes. Die genetika onderliggend aan die gekreukelde dwerg eienskap is ondersoek deur die segregasiepatrone van die eerste filiale generasie (F1) nageslag te bestudeer, waar ouerkombinasies heterosigoties was. Segregasieverhoudings van 9:7 en 3:1 is waargeneem waar gekreukelde dwergfenotipes uitgedruk word wanneer een van die twee gene homosigoties resessief is (D-ee of ddE). Verder is die betrokkenheid van self-onverenigbaarheid (S) ondersoek deur die ouerlike S-genotipes, met behulp van PKR-gebaseerde konsensus en alleelspesifieke inleiers van die appel S-RNAse geen, te identifiseer. Agt ouerlike S-genotipes is bepaal. Die S-genotipes van Malling 1 ('M.1') (S3S9) en TSR1T187 (S7S24) is vir die eerste keer in hierdie studie bepaal. Hoë-digtheid SNP-gebaseerde ouer genetiese koppelingskaarte van 'McIntosh' en 'M.1' is saamgestel met behulp van die appel 20K Infinium “SNP-array”. Die gekreukelde dwerg eienskap is gekarteer op die koppelingsgroep (“linkage group”, LG) 8 in 'McIntosh' en op LG2 in 'M.1'. Op die konsensus genetiese kaart word gekreukelde dwerg eienskap ook op LG8 gekarteer. Die gekreukelde dwerg eienskap wat verkry is vir die ouerlike genetiese kaarte is ook bevestig met behulp van Kruskal- Wallis (KW) analise. Om dieper insigte te verkry in die gene wat die gekreukelde dwergfenotipe reguleer, is transkriptoom profiele van saamgevoegde meristematiese weefsels van normale en gekreukelde dwergfenotipes gegenereer met behulp van RNA-opeenvolgingstegnologie. 'n Totaal van 921 gene wat betekenisvol differensieel uitgedruk word (“differentially expressed genes”, DEG's), met 763 op- gereguleerde en 158 af-gereguleerde transkripte, is geïdentifiseer. Hierdie geen uitdrukkings analises het aan die lig gebring dat die verdedigings en stresverwante gene tydens die uitdrukking van 'n gekreukelde dwergfenotipe op-gereguleer is, tesame met die aktivering van verskeie antioksidantproteïene / ensieme. Die hoë uitdrukking van laktoperoksidase (Klas III peroksidase), tesame met “glutathion S-transferase” dui op die betrokkenheid van reaktiewe suurstofspesies (“reactive oxygen species “, ROS). Gene wat vir patogeenverwante proteïene (chitinase en pektien), antioksidantensieme, reseptoragtige proteïene (proteïne serien / treonien fosfatase) kodeer, asook alfa- linoleensuur, 'n voorloper van die fitohormoon jasmonsuur, is almal tydens die uitdrukking van die gekreukelde dwergfenotipe op-gereguleer. Hierdie bevindings ondersteun die gedagte dat die gekreukelde dwergfenotipe wel hibriede nekrose simptome vertoon. 'n Outo-immuunrespons kon gevolglike veroorsaak geword het deur alleelonverenigbaarheid, in hierdie geval tussen 'McIntosh' en 'M.1'. Gevolglik sal die inligting wat in hierdie studie gegenereer is, help om 'n interne siftingstelsel daar te stel om saailinge wat gekreukelde dwerggene het, te elimineer uit die LNR-teelmateriaal. In die toekoms sal hierdie bevindinge ook help met die samestelling van kruisings met voorspelbare uitkomste en die daarstel van 'n volhoubare genetiese basis van appelkultivars, vir boorde met 'n hoë produktiwiteit, terwyl die dwerggroeiwyse verbonde aan gekreukelde blare vermy word.
Description
Thesis (PhDAgric)--Stellenbosch University, 2020.
Keywords
Apple (Malus pumila Mill.) -- Breeding, Hybrid necrosis -- Genetics, Plants -- Self-incompatibility, Transcriptomics, Apple industry -- South Africa, Dwarf fruit trees -- Hybridization, UCTD