The uptake mechanism of poly(styrene-co-maleic acid) based particles by mammalian cells
Date
2020-02
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: The intracellular fate of nanocarriers determine the success and efficiency of target specific drug delivery systems and are highly dependent on the cellular uptake mechanism and the chemical composition of the nanocarriers. Poly(styrene-co-maleic anhydride) (SMAnh) possesses many sought after properties, which make it attractive for the use in drug delivery systems. The highly reactive maleic anhydride units allow for easy modification or attachment of drugs through ester or amide linkages. Hydrolysis of these maleic anhydride groups to form poly(styrene-co-maleic acid) (SMA) makes this polymer water soluble and biocompatible, and the amphiphilic nature also allows noncovalent association with hydrophobic drugs. To exploit these properties of SMA for intracellular drug delivery the uptake mechanism of SMA based NPs by mammalian cells was investigated. Different synthesis methods to produce poly(styrene-co-maleic anhydride-co-divinylbenzene) nanoparticles (SMANPs) were investigated, and the most promising results for control over SMANPs size were obtained using a tubular reactor. The size of the SMANPs could easily be controlled by the flowrate at which the monomer solution is pushed through the tube. SMANPs between 150 nm and 450 nm, with narrow size distributions, could be readily prepared with this method. The size was limited only by the length of the tubular reactor, and a longer reactor is anticipated to allow the synthesis of larger SMANPs. These SMANPs have intrinsic fluorescence properties; characterization by fluorescence spectroscopy exhibited an intense emission, between 290 – 375 nm, which was attributed to immobilized phenyl rings in the highly crosslinked SMANPs. The SMANPs were used as a model system to investigate the uptake mechanism of SMA based NPs by mammalian cells. Different sized hydrolyzed SMANPs (200 – 900 nm) and SMANPs functionalized with different amine derivates were used to investigate the effect of size and surface characteristics, on the uptake and uptake mechanism in two non-phagocytic cell lines, Vero and EA.hy 296. Results showed that all the NPs could be internalized into the cytosol of the cells, which confirmed the potential of SMA based NPs to be used in intracellular drug delivery. The hypothesis that SMA based NPs can enter mammalian cells through passive diffusion was investigated by inhibition of the endocytic mechanisms through the use of specific pharmacological inhibitors and low experimental temperatures (4 °C), to inhibit all energy dependent processes. Clathrin mediated endocytosis and caveolae mediated endocytosis could have contributed to the uptake of the NPs (360 nm) functionalized with ammonia, ethanol amine and DMAPA in both Vero and EA.hy926 cells. Non - specific uptake by macropinocytosis for some NPs could not be completely ruled out. However, high uptake (60 to 100 %) at 4 °C, was maintained for many hydrolyzed SMANPs with different sizes and NPs with different functionalizations in Vero and EAhy.296 cells, suggesting that passive diffusion through the cell membranes is likely. Very low hemolysis percentages after addition of these NPs to red blood cells were observed, suggesting that after NP internalization, the cell membranes were not permanently disrupted. Given the novelty of these observations, future work is imperative to further probe the cellular uptake of these NP.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Die intrasellulêre lot van nanodraers bepaal die sukses en doeltreffendheid van teikenspesifieke medisyne-afleweringstelsels en is baie afhanklik van die sellulêre opname-meganisme en die chemiese samestelling van die nanodraers. Poli (stireen-ko-maleïne-anhidried) (SMAnh) het baie gesogte eienskappe, wat dit aantreklik maak vir gebruik in medisyne-afleweringstelsels. Die hoogs reaktiewe maleïne-anhidried groepe maak modifikasies maklik, en dwelms kan gemaklik deur esterof amiedkoppelings aangeheg word. Die hidrolise van hierdie maleïne-anhidried groepe om poli (stireen-ko-maleïnesuur) (SMA) te vorm, maak hierdie polimeer wateroplosbaar en bioversoenbaar, en die amfifiele aard laat ook nie-kovalente assosiasie toe met hidrofobiese middels. Om hierdie eienskappe van SMA te benut vir intrasellulêre medisyne-aflewering, is die opname-meganisme van SMA-gebaseerde NP's deur soogdierselle ondersoek. Verskillende sintetiseringsmetodes om poli (stireen-ko-maleïne anhidried-ko-divinielbenseen) nanopartiekels (SMANP's) te vervaardig, is ondersoek, en die mees belowende resultate vir die beheer oor die grootte van die SMANP's is verkry met behulp van 'n buisreaktor. Die grootte van die SMANP's kan maklik beheer word deur die vloeitempo waarop die monomeeroplossing deur die buis gedruk word. SMANP's tussen 150 nm en 450 nm, met smal grootte verspreidings, kan maklik met hierdie metode voorberei word. Die grootte is slegs beperk deur die lengte van die buisreaktor, en 'n langer reaktor word verwag om die samestelling van groter SMANP's moontlik te maak. Hierdie SMANP's het intrinsieke fluoressensieeienskappe; karakterisering deur fluoressensie spektroskopie het 'n intense emissie getoon, tussen 290 - 375 nm, wat toegeskryf word aan geïmmobiliseerde benseen ringe in die sterk verkoppelde network van die SMANP's. Die SMANP's is gebruik as 'n modelleerstelsel om die opname-meganisme van SMA- ebaseerde NP's deur soogdierselle te ondersoek. Verskillende groottes gehidroliseer SMANP's (200 - 900 nm) en SMANP's gefunksionaliseer met verskillende amienderivate, is gebruik om die effek van grootte en oppervlakkenmerke op die opname en opname meganisme in twee nie-fagositiese sellyne, Vero en EA.hy 296, te ondersoek. Resultate het getoon dat al die NP's in die sitosol van die selle geïnternaliseer kon word, wat die potensiaal van SMA-gebaseerde NP's vir intrasellulêre medisyne-aflewering gebruik bevestig. Die hipotese dat SMA-gebaseerde NP's soogdierselle deur passiewe diffusie kan binnedring, is ondersoek deur die endositiese meganismes te inhebeer deur die gebruik van spesifieke farmakologiese inhibeerders en lae eksperimentele temperatuur (4 ° C) om alle energie-afhanklike prosesse te inhibeer. Clathrin-gemedieerde endositose en caveolae-gemedieerde endositose kon bygedra het tot die opname van die NP's (360 nm) wat met ammoniak, etanolamien en DMAPA gefunksionaliseer is in beide Vero- en EA.hy926-selle. Nie-spesifieke opname deur makropinositose vir sommige NP's kan nie heeltemal uitgesluit word nie. Hoë opname (60 tot 100%) by 4 ° C is egter gehandhaaf vir baie gehidroliseerde SMANP's met verskillende groottes en NP's met verskillende funksionele groepe in Vero- en EAhy.296-selle, wat daarop dui dat passiewe diffusie deur die selmembrane waarskynlik is. Na die toevoeging van hierdie NP's tot rooibloedselle is daar baie lae hemolise-persentasies waargeneem, wat daarop dui dat die selmembrane na NP-internalisering nie permanent onderbreek is nie. Gegewe die nuutheid van hierdie waarnemings, is toekomstige werk noodsaaklik om die sellulêre opname van hierdie NP verder te ondersoek.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Die intrasellulêre lot van nanodraers bepaal die sukses en doeltreffendheid van teikenspesifieke medisyne-afleweringstelsels en is baie afhanklik van die sellulêre opname-meganisme en die chemiese samestelling van die nanodraers. Poli (stireen-ko-maleïne-anhidried) (SMAnh) het baie gesogte eienskappe, wat dit aantreklik maak vir gebruik in medisyne-afleweringstelsels. Die hoogs reaktiewe maleïne-anhidried groepe maak modifikasies maklik, en dwelms kan gemaklik deur esterof amiedkoppelings aangeheg word. Die hidrolise van hierdie maleïne-anhidried groepe om poli (stireen-ko-maleïnesuur) (SMA) te vorm, maak hierdie polimeer wateroplosbaar en bioversoenbaar, en die amfifiele aard laat ook nie-kovalente assosiasie toe met hidrofobiese middels. Om hierdie eienskappe van SMA te benut vir intrasellulêre medisyne-aflewering, is die opname-meganisme van SMA-gebaseerde NP's deur soogdierselle ondersoek. Verskillende sintetiseringsmetodes om poli (stireen-ko-maleïne anhidried-ko-divinielbenseen) nanopartiekels (SMANP's) te vervaardig, is ondersoek, en die mees belowende resultate vir die beheer oor die grootte van die SMANP's is verkry met behulp van 'n buisreaktor. Die grootte van die SMANP's kan maklik beheer word deur die vloeitempo waarop die monomeeroplossing deur die buis gedruk word. SMANP's tussen 150 nm en 450 nm, met smal grootte verspreidings, kan maklik met hierdie metode voorberei word. Die grootte is slegs beperk deur die lengte van die buisreaktor, en 'n langer reaktor word verwag om die samestelling van groter SMANP's moontlik te maak. Hierdie SMANP's het intrinsieke fluoressensieeienskappe; karakterisering deur fluoressensie spektroskopie het 'n intense emissie getoon, tussen 290 - 375 nm, wat toegeskryf word aan geïmmobiliseerde benseen ringe in die sterk verkoppelde network van die SMANP's. Die SMANP's is gebruik as 'n modelleerstelsel om die opname-meganisme van SMA- ebaseerde NP's deur soogdierselle te ondersoek. Verskillende groottes gehidroliseer SMANP's (200 - 900 nm) en SMANP's gefunksionaliseer met verskillende amienderivate, is gebruik om die effek van grootte en oppervlakkenmerke op die opname en opname meganisme in twee nie-fagositiese sellyne, Vero en EA.hy 296, te ondersoek. Resultate het getoon dat al die NP's in die sitosol van die selle geïnternaliseer kon word, wat die potensiaal van SMA-gebaseerde NP's vir intrasellulêre medisyne-aflewering gebruik bevestig. Die hipotese dat SMA-gebaseerde NP's soogdierselle deur passiewe diffusie kan binnedring, is ondersoek deur die endositiese meganismes te inhebeer deur die gebruik van spesifieke farmakologiese inhibeerders en lae eksperimentele temperatuur (4 ° C) om alle energie-afhanklike prosesse te inhibeer. Clathrin-gemedieerde endositose en caveolae-gemedieerde endositose kon bygedra het tot die opname van die NP's (360 nm) wat met ammoniak, etanolamien en DMAPA gefunksionaliseer is in beide Vero- en EA.hy926-selle. Nie-spesifieke opname deur makropinositose vir sommige NP's kan nie heeltemal uitgesluit word nie. Hoë opname (60 tot 100%) by 4 ° C is egter gehandhaaf vir baie gehidroliseerde SMANP's met verskillende groottes en NP's met verskillende funksionele groepe in Vero- en EAhy.296-selle, wat daarop dui dat passiewe diffusie deur die selmembrane waarskynlik is. Na die toevoeging van hierdie NP's tot rooibloedselle is daar baie lae hemolise-persentasies waargeneem, wat daarop dui dat die selmembrane na NP-internalisering nie permanent onderbreek is nie. Gegewe die nuutheid van hierdie waarnemings, is toekomstige werk noodsaaklik om die sellulêre opname van hierdie NP verder te ondersoek.
Description
Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2020.