The effects of kirrel1 isoform expression on C2C12 differentiation and fusion in vitro
Date
2023-03
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Adult skeletal muscle myogenesis involves the fusion of muscle progenitor cells into
multi-nucleated
myofibers, a process crucial for the growth and repair of muscle tissue. Vertebrate myoblast fusion
is a relatively poorly understood process that involves a multitude of cell adhesion molecules,
actin regulators and fusion proteins. A more comprehensive understanding of myogenesis is essential
to better assess muscle myopathies and for the development of improved interventions. The kirrel
family of mammalian cell adhesion molecules are highly involved in the production and maintenance
of complex tissue structures such as the slit diaphragm in the kidney. The Drosophila paralogs of
the kirrel proteins are known to be vital for actin regulation during myoblast fusion with the
mechanisms of this regulation being mostly understood. However, these same findings have not been
confirmed with regards to mammalian myoblast fusion; an arguably more complex process than that in
the fly. It has been demonstrated that kirrel1A and its associated splice variant, kirrel1B, are
differentially expressed in regenerating mouse muscle tissue; although, the exact roles of these
molecules during this process are not clear. More recently, kirrel3 has been shown to be required
for the successful fusion of mouse myoblasts. The aim of this study was to determine the effects of
kirrel1A and kirrel1B expression levels on C2C12 differentiation and fusion in vitro. Three
genetic strategies were employed to assess kirrel1 activity during C2C12 myogenesis, these being;
CRISPR/Cas9 modification, shRNA knockdown and retroviral overexpression. CRISPR/Cas9 was used to
disrupt kirrel1 expression by modifying genomic regulatory regions between exons 1 and 2 of the
gene. The individual knockdown/inhibition of kirrel1A and kirrel1B mRNA activity was achieved using
shRNAs. Overexpression was carried out by wild-type kirrel1A and kirrel1B gene-cloning followed by
retroviral transduction. Additionally, a kirrel1A-mCherry mutant was overexpressed in the C2C12s.
The differentiation of the various cell lines was assessed via western blotting, PCR analysis and
phase-contrast microscopy. The experiments suggest that although the moderate overexpression of
kirrel1A or kirrel1B has little effect on myotube production, the gross overexpression of kirrel1
variants leads to a drastic reduction in myogenesis, potentially due to increased steric hindrance
at the cell surface. Moreover, our findings demonstrate the requirement for kirrel1A during myotube
formation as no tubes were seen in kirrel1A-knockdown myoblasts. This inhibition appeared to be
unrelated to the expression of the myogenic regulatory factors. However, it is still unclear
whether there is a similar requirement for kirrel1B during fusion. The expression of a mutant form
of kirrel1A with an mCherry tag inserted close to an intracellular cleavage site resulted in a
complete lack of myotubes; seemingly due to altered early MRF expression. In each case where cell
lines produced myotubes, non-reducing western blotting revealed large kirrel1-containing
complexes that accumulated as fusion progressed. These complexes were not seen in any of the
non-fusing cell lines. From the results it is apparent that kirrel1 is required for healthy
myogenesis and that further research is required to fully understand the mechanisms of this
regulation.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Volwasse skeletspier miogenese behels die samesmelting van spiervoorloperselle in multi-kern miovesels, 'n proses wat noodsaaklik is vir die groei en herstel van spierweefsel. Vertebrate mioblaste samesmelting is 'n relatief swak verstaande proses wat 'n menigte sel adhesie molekules, aktien reguleerders en samesmeltings proteïene behels. 'n Meer omvattende begrip van miogenese is noodsaaklik om spiermiopatologie beter te assesseer en vir die ontwikkeling van verbeterde intervensies. Die kirrelfamilie van soogdier seladhesiemolekules is hoogs betrokke by die produksie en instandhouding van komplekse weefselstrukture soos die spleetdiafragma in die nier. Dit is bekend dat die Drosophila-paraloë van die kirrel-proteïene noodsaaklik is vir aktienregulering tydens mioblastesamesmelting, met die meganismes van hierdie regulering wat meestal verstaan word. Hierdie bevindinge is egter nie bevestig met betrekking tot soogdier mioblastfusie nie; 'n waarskynlik meer komplekse proses as dié in die vlieg. Dit is gedemonstreer dat kirrel1A en sy geassosieerde splitsingsvariant, kirrel1B, differensieel uitgedruk word in regenererende muisspierweefsel; alhoewel, die presiese rolle van hierdie molekules tydens hierdie proses is nie duidelik nie. Meer onlangs is getoon dat kirrel3 benodig word vir die suksesvolle samesmelting van muismioblaste. Die doel van hierdie studie was om die effekte van kirrel1A en kirrel1B uitdrukkingsvlakke op C2C12 differensiasie en samesmelting in vitro te bepaal. Drie genetiese strategieë is aangewend om kirrel1- aktiwiteit tydens C2C12-miogenese te bepaal, hierdie is; CRISPR/Cas9-modifikasie, shRNA-afslaan en retrovirale ooruitdrukking. CRISPR/Cas9 is gebruik om kirrel1-uitdrukking te ontwrig deur genomiese regulatoriese streke tussen eksons 1 en 2 van die geen te wysig. Die individuele knockdown / inhibisie van kirrel1A en kirrel1B mRNA aktiwiteit is bereik met behulp van shRNAs. Ooruitdrukking is uitgevoer deur wilde-tipe kirrel1A en kirrel1B geenkloning gevolg deur retrovirale transfeksie. Daarbenewens is 'n kirrel1A-mCherry mutant ooruitgedruk in die C2C12s. Die differensiasie van die verskillende sellyne is beoordeel deur middel van Westerse kladding, PCR- analise en fasekontrasmikroskopie. Ons eksperimente dui daarop dat alhoewel die matige ooruitdrukking van kirrel1A of kirrel1B min effek op miobuisproduksie het, die growwe ooruitdrukking van kirrel1 variante lei tot 'n drastiese vermindering in miogenese, moontlik as gevolg van verhoogde steriese hindering by die seloppervlak. Boonop demonstreer ons bevindinge die vereiste vir kirrel1A tydens miobuisvorming aangesien geen buise in kirrel1A-afslaan-mioblaste gesien is nie. Hierdie inhibisie blyk nie verband te hou met die uitdrukking van die miogeniese regulerende faktore nie. Dit is egter nog onduidelik of daar 'n soortgelyke vereiste vir kirrel1B tydens samesmelting is. Die uitdrukking van 'n mutante vorm van kirrel1A met 'n mCherry-merker wat naby 'n intrasellulêre splitsingsplek ingevoeg is, het gelei tot 'n volledige gebrek aan miobuise; skynbaar as gevolg van veranderde vroeë MRF-uitdrukking. In elke geval waar sellyne miobuise geproduseer het, het nie-reduserende Westerse kladding groot kirrel1-bevattende komplekse aan die lig gebring wat opgehoop het soos die samesmelting gevorder het. Hierdie komplekse is nie in enige van die nie-samesmeltende sellyne gesien nie. Uit die resultate is dit duidelik dat kirrel1 nodig is vir gesonde miogenese en dat verdere navorsing nodig is om die meganismes van hierdie regulasie ten volle te verstaan.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Volwasse skeletspier miogenese behels die samesmelting van spiervoorloperselle in multi-kern miovesels, 'n proses wat noodsaaklik is vir die groei en herstel van spierweefsel. Vertebrate mioblaste samesmelting is 'n relatief swak verstaande proses wat 'n menigte sel adhesie molekules, aktien reguleerders en samesmeltings proteïene behels. 'n Meer omvattende begrip van miogenese is noodsaaklik om spiermiopatologie beter te assesseer en vir die ontwikkeling van verbeterde intervensies. Die kirrelfamilie van soogdier seladhesiemolekules is hoogs betrokke by die produksie en instandhouding van komplekse weefselstrukture soos die spleetdiafragma in die nier. Dit is bekend dat die Drosophila-paraloë van die kirrel-proteïene noodsaaklik is vir aktienregulering tydens mioblastesamesmelting, met die meganismes van hierdie regulering wat meestal verstaan word. Hierdie bevindinge is egter nie bevestig met betrekking tot soogdier mioblastfusie nie; 'n waarskynlik meer komplekse proses as dié in die vlieg. Dit is gedemonstreer dat kirrel1A en sy geassosieerde splitsingsvariant, kirrel1B, differensieel uitgedruk word in regenererende muisspierweefsel; alhoewel, die presiese rolle van hierdie molekules tydens hierdie proses is nie duidelik nie. Meer onlangs is getoon dat kirrel3 benodig word vir die suksesvolle samesmelting van muismioblaste. Die doel van hierdie studie was om die effekte van kirrel1A en kirrel1B uitdrukkingsvlakke op C2C12 differensiasie en samesmelting in vitro te bepaal. Drie genetiese strategieë is aangewend om kirrel1- aktiwiteit tydens C2C12-miogenese te bepaal, hierdie is; CRISPR/Cas9-modifikasie, shRNA-afslaan en retrovirale ooruitdrukking. CRISPR/Cas9 is gebruik om kirrel1-uitdrukking te ontwrig deur genomiese regulatoriese streke tussen eksons 1 en 2 van die geen te wysig. Die individuele knockdown / inhibisie van kirrel1A en kirrel1B mRNA aktiwiteit is bereik met behulp van shRNAs. Ooruitdrukking is uitgevoer deur wilde-tipe kirrel1A en kirrel1B geenkloning gevolg deur retrovirale transfeksie. Daarbenewens is 'n kirrel1A-mCherry mutant ooruitgedruk in die C2C12s. Die differensiasie van die verskillende sellyne is beoordeel deur middel van Westerse kladding, PCR- analise en fasekontrasmikroskopie. Ons eksperimente dui daarop dat alhoewel die matige ooruitdrukking van kirrel1A of kirrel1B min effek op miobuisproduksie het, die growwe ooruitdrukking van kirrel1 variante lei tot 'n drastiese vermindering in miogenese, moontlik as gevolg van verhoogde steriese hindering by die seloppervlak. Boonop demonstreer ons bevindinge die vereiste vir kirrel1A tydens miobuisvorming aangesien geen buise in kirrel1A-afslaan-mioblaste gesien is nie. Hierdie inhibisie blyk nie verband te hou met die uitdrukking van die miogeniese regulerende faktore nie. Dit is egter nog onduidelik of daar 'n soortgelyke vereiste vir kirrel1B tydens samesmelting is. Die uitdrukking van 'n mutante vorm van kirrel1A met 'n mCherry-merker wat naby 'n intrasellulêre splitsingsplek ingevoeg is, het gelei tot 'n volledige gebrek aan miobuise; skynbaar as gevolg van veranderde vroeë MRF-uitdrukking. In elke geval waar sellyne miobuise geproduseer het, het nie-reduserende Westerse kladding groot kirrel1-bevattende komplekse aan die lig gebring wat opgehoop het soos die samesmelting gevorder het. Hierdie komplekse is nie in enige van die nie-samesmeltende sellyne gesien nie. Uit die resultate is dit duidelik dat kirrel1 nodig is vir gesonde miogenese en dat verdere navorsing nodig is om die meganismes van hierdie regulasie ten volle te verstaan.
Description
Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2023.