The detection of stress-related diseases: establishment of two unique methods to discover circulatory phospho- and glycoproteins
Date
2023-12
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Introduction: Psychosocial stress has strong links to numerous chronic diseases related to the
dysregulated activation of the physiological stress system. This heightens the burden of mortality
as there is a robust relationship between chronic psychosocial stress and non- communicable
diseases. Hence there is a robust impetus for the identification of novel, circulating biomarkers
to earlier detect stress-related chronic diseases. Although protein post-translational
modifications such as glycosylation and phosphorylation can act as putative markers of
pathophysiology, their relatively low abundance complicates extraction and identification from
samples with a high dynamic range. The main aim of this study was therefore to establish two unique
enrichment methods for circulatory glycoprotein and phosphoprotein extraction that would then be
applied in a preclinical model of chronic psychosocial stress.
Methods: Phosphoprotein enrichment was performed using functionalized magnetic particles while
glycoprotein enrichment occurred using lectin-bound magnetic particles. Both these methods were
tested using a known purified phosphorylated and glycosylated protein and compared to bottom-up
proteomics methodology using rat serum. The latter was obtained from a rat model of chronic stress
that is well-established in our laboratory (n = 16 controls versus n = 16 stressed rats). These
were randomly selected for proteomics analysis to assess the efficiency of retrieval in enriched
versus unenriched samples. Fractions were analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE) and proteins visualized using Coomassie and specific fluorescent
staining. Here, the relevant Pro-Q stains were employed for the identification of glycosylation and
phosphorylation, respectively. The coupling of such enrichment methods to LC – tandem mass
spectrometry (MS/MS) was enabled by employing various preparation steps such as deglycosylation and
digestion. An exogenous protein was also included as part of the sample preparation to ensure
quality control analysis of the LC-MS/MS experiment.
Results: SDS-PAGE analyses and staining methods revealed non-specific enrichment with regards to
intact protein retrieval. In addition, LC-MS/MS data demonstrated that enrichment using the current
set of affinity materials was inadequate for glycopeptide and phosphopeptide retrieval in serum.
Conclusion: A lack of enrichment indicates that stringent sample preparation is needed for biological materials with a high dynamic range. This may also be due to the porous nature of both materials employed for phospho- and glycoprotein/peptide enrichment respectively. A combination of enrichment and/or depletion methods may therefore be beneficial for deeper analysis of the blood proteome. These enrichment techniques and the subsequent sample preparation still require further optimization to derive more definitive conclusions in the chronic stress context.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Inleiding: Psigososiale stres het sterk skakels met talle chroniese siektes wat verband hou met die gedisreguleerde aktivering van die fisiologiese stresstelsel. Dit verhoog die las van sterftes aangesien daar 'n sterk verband tussen chroniese psigososiale stres en nie- oordraagbare siektes is. Daar is dus 'n sterk motivering vir die identifisering van nuwe, sirkulerende biomerkers om stresverwante chroniese siektes vroeër op te spoor. Alhoewel proteïen-post-translasionele modifikasies soos glikosilasie en fosforilering as herkende merkers van patofisiologie kan dien, bemoeilik hul relatief lae hoeveelheid ekstraksie en identifikasie vanuit monsters met 'n hoë dinamiese omvang. Die hoofdoel van hierdie studie was dus om twee unieke verrykingsmetodes vir sirkulatoriese glikoproteïen- en fosfoproteïenontginning daar te stel, wat dan in 'n prekliniese model van chroniese psigososiale stres toegepas sou word. Metodes: Fosfoproteïenverryking is uitgevoer met behulp van gefunksioneerde magnetiese partikels, terwyl glikoproteïenverryking plaasgevind het met behulp van lektiengebonde magnetiese partikels. Albei hierdie metodes is getoets met behulp van 'n bekende gesuiwerde gefosforileerde en glikosileerde proteïen en in vergelyking met onder-na-bo proteomiese-metodologie met behulp van rotserum. Laasgenoemde is verkry uit 'n rotmodel van chroniese stres wat goed gevestig is in ons laboratorium (n = 16 kontroles teenoor n = 16 gestresde rotte). Dit is lukraak gekies vir proteomiese-analise om die doeltreffendheid van herwinning in verrykte teenoor onverrykte monsters te bepaal. Fraksies is ontleed deur natriumdodesielsulfaat poliakrylamiedgelelektroforese (SDS-PAGE) en proteïene gevisualiseer met behulp van Coomassie en spesifieke fluoresserende kleuring. Hier is die relevante Pro-Q-kleurstowwe gebruik vir die identifisering van onderskeidelik glikosilasie en fosforilering. Die koppeling van sulke verrykingsmetodes aan vloeistofchromatografie (VC) - tandemmassaspektrometrie (MS/MS) is moontlik gemaak deur gebruik te maak van verskillende voorbereidingsstappe soos deglikosilasie en vertering. ‘n Eksogene proteïen is ook ingesluit as deel van die monstervoorbereiding om kwaliteitsbeheeranalise van die VC-MS/MS-eksperiment te verseker. Resultate: SDS-PAGE-ontledings en kleuringsmetodes het nie-spesifieke verryking met betrekking tot ongeskonde proteïenherwinning aan die lig gebring. Daarbenewens het VC- MS/MS-data getoon dat verryking met behulp van die huidige stel affiniteitsmateriaal onvoldoende was vir glikopeptied- en fosfopeptied-herwinning in serum. Gevolgtrekking: 'n Gebrek aan verryking dui daarop dat streng monstervoorbereiding nodig is vir biologiese materiale met 'n hoë dinamiese omvang. Dit kan ook te wyte wees aan die poreuse aard van beide materiale wat onderskeidelik vir fosfoproteïen- en glikoproteïenverryking gebruik word. 'n Kombinasie van verrykings- en/of uitputtingsmetodes kan dus voordelig wees vir dieper ontleding van die bloedproteoom. Hierdie verrykingstegnieke en die daaropvolgende steekproefvoorbereiding vereis steeds verdere optimalisering om meer definitiewe gevolgtrekkings in die chroniese streskonteks af te lei.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Inleiding: Psigososiale stres het sterk skakels met talle chroniese siektes wat verband hou met die gedisreguleerde aktivering van die fisiologiese stresstelsel. Dit verhoog die las van sterftes aangesien daar 'n sterk verband tussen chroniese psigososiale stres en nie- oordraagbare siektes is. Daar is dus 'n sterk motivering vir die identifisering van nuwe, sirkulerende biomerkers om stresverwante chroniese siektes vroeër op te spoor. Alhoewel proteïen-post-translasionele modifikasies soos glikosilasie en fosforilering as herkende merkers van patofisiologie kan dien, bemoeilik hul relatief lae hoeveelheid ekstraksie en identifikasie vanuit monsters met 'n hoë dinamiese omvang. Die hoofdoel van hierdie studie was dus om twee unieke verrykingsmetodes vir sirkulatoriese glikoproteïen- en fosfoproteïenontginning daar te stel, wat dan in 'n prekliniese model van chroniese psigososiale stres toegepas sou word. Metodes: Fosfoproteïenverryking is uitgevoer met behulp van gefunksioneerde magnetiese partikels, terwyl glikoproteïenverryking plaasgevind het met behulp van lektiengebonde magnetiese partikels. Albei hierdie metodes is getoets met behulp van 'n bekende gesuiwerde gefosforileerde en glikosileerde proteïen en in vergelyking met onder-na-bo proteomiese-metodologie met behulp van rotserum. Laasgenoemde is verkry uit 'n rotmodel van chroniese stres wat goed gevestig is in ons laboratorium (n = 16 kontroles teenoor n = 16 gestresde rotte). Dit is lukraak gekies vir proteomiese-analise om die doeltreffendheid van herwinning in verrykte teenoor onverrykte monsters te bepaal. Fraksies is ontleed deur natriumdodesielsulfaat poliakrylamiedgelelektroforese (SDS-PAGE) en proteïene gevisualiseer met behulp van Coomassie en spesifieke fluoresserende kleuring. Hier is die relevante Pro-Q-kleurstowwe gebruik vir die identifisering van onderskeidelik glikosilasie en fosforilering. Die koppeling van sulke verrykingsmetodes aan vloeistofchromatografie (VC) - tandemmassaspektrometrie (MS/MS) is moontlik gemaak deur gebruik te maak van verskillende voorbereidingsstappe soos deglikosilasie en vertering. ‘n Eksogene proteïen is ook ingesluit as deel van die monstervoorbereiding om kwaliteitsbeheeranalise van die VC-MS/MS-eksperiment te verseker. Resultate: SDS-PAGE-ontledings en kleuringsmetodes het nie-spesifieke verryking met betrekking tot ongeskonde proteïenherwinning aan die lig gebring. Daarbenewens het VC- MS/MS-data getoon dat verryking met behulp van die huidige stel affiniteitsmateriaal onvoldoende was vir glikopeptied- en fosfopeptied-herwinning in serum. Gevolgtrekking: 'n Gebrek aan verryking dui daarop dat streng monstervoorbereiding nodig is vir biologiese materiale met 'n hoë dinamiese omvang. Dit kan ook te wyte wees aan die poreuse aard van beide materiale wat onderskeidelik vir fosfoproteïen- en glikoproteïenverryking gebruik word. 'n Kombinasie van verrykings- en/of uitputtingsmetodes kan dus voordelig wees vir dieper ontleding van die bloedproteoom. Hierdie verrykingstegnieke en die daaropvolgende steekproefvoorbereiding vereis steeds verdere optimalisering om meer definitiewe gevolgtrekkings in die chroniese streskonteks af te lei.
Description
Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2023.