Molecular evaluation of tuberculosis agents on a H9c2 rat ventricular cardiomyoblast model.
Date
2023-12
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Tuberculosis (TB) remains a significant global health challenge, demanding ongoing assessment of the efficacy and safety of its therapeutic agents. This study focused on evaluating the potential cardiotoxicity of four anti-tuberculosis drugs, namely isoniazid, ethambutol, pyrazinamide, and rifampicin, on H9c2 rat ventricular cardiomyoblasts. Cardiotoxicity is a critical concern since these drugs are administered for extended periods. This prospective in vitro study encompassed three key phases. In the first phase, the study assessed the metabolic activity of first-line anti-TB drugs, secondary metabolites of Mycobacterium smegmatis mc2155, and M. smegmatis mc2155- infected H9c2 cells via MTT assays. The second phase aimed to determine the extent and mode of cell death induced by these substances through flow cytometry. Finally, the third phase involved an evaluation of mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) using the Oroboros Oxygraph-2K. The first-line anti-TB drugs exhibited no cytotoxic effect on the cells. In contrast, the metabolites of M. smegmatis mc2155 displayed a concentration-dependent decrease in cell viability, with higher concentrations resulting in lower viability. Notably, the 25mg/mL concentration exhibited cytotoxic effects on the cells. When M. smegmatis mc2155-infected H9c2 cells were treated with the first-line anti-TB drugs, rifampicin showed a reduced cell viability of 57% compared to the control, indicating the cells' susceptibility to infection. Notably, infected cells consistently displayed lower viability across all drug treatments compared to their uninfected counterparts. Furthermore, the study revealed that treatment with rifampicin and M. smegmatis mc2155 secondary metabolites led to an increase in early apoptotic cells. This suggests efficient activation of apoptosis pathways compared to the untreated control (0.08%). Additionally, DMSO (10%) demonstrated a statistically significant decrease in the number of viable cells (29.07%) compared to the untreated control (99.58%), coupled with an increase in necrosis (70.93%) in contrast to the 0.14% observed in the untreated control. Variations in basal respiration rates were observed among the treatment groups compared to the untreated control. Leak respiration, associated with proton leak across the inner mitochondrial Stellenbosch University https://scholar.sun.ac.za iii membrane, increased when cells were treated with rifampicin and M. smegmatis mc2155, indicating a disturbance in mitochondrial function and the inner mitochondrial membrane. OXPHOS CI+CII activity, involving both Complexes I and II, exhibited a significant reduction in the oxygen consumption of the cells in all the treatment groups compared to the untreated control. This reduction points to a potential disruption in this specific segment of the electron transport chain. In summary, this study emphasises the impact of first-line anti-TB drugs on cardiac cells, considering the potential for drug-induced cardiotoxicity. The results suggest that H9c2 cardiomyoblasts are susceptible to infection with M. smegmatis mc2155. Moreover, M. smegmatis mc2155secondary metabolites significantly affect metabolic activity, induce early apoptosis, and disrupt electron flow in the electron transport chain. These findings warrant further investigations, particularly exploring the effects of first-line drugs in a 3D or animal model.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Tuberkulose (TB) bly 'n beduidende globale gesondheids uitdaging wat 'n voortdurende evaluering van die doeltreffendheid en veiligheid van sy terapeutiese middels vereis. Hierdie studie het gefokus op die evaluering van die potensiële kardiotoksisiteit van vier antituberkulosemiddels, naamlik isoniasied, etambutol, pirasienamied, en rifampisien, op H9c2-rat ventrikulêre kardiomioblaste. Kardiotoksisiteit is 'n kritieke kommer, aangesien hierdie middels oor 'n lang tydperk toegedien word. Hierdie vooruitsigte in vitro studie het drie belangrike fases ingesluit. In die eerste fase het die studie die metaboliese aktiwiteit van eerstelyns antituberkulose middels, sekondêre metaboliete van Mycobacterium smegmatis mc2155, en M. smegmatis mc2155-geïnfekteerde H9c2-selle geëvalueer deur middel van MTT-toetse. Die tweede fase het ten doel gehad om die omvang en wyse van selsterfte wat deur hierdie stowwe veroorsaak word, deur middel van vloeisitometrie te bepaal. Laastens het die derde fase ‘n evaluering van mitochondriale oksidatiewe fosforilasie (OXPHOS) met behulp van die Oroboros Oxygraph-2K ingesluit. Die eerstelyns antituberkulose middels het geen sitotoksiese effek op die selle getoon nie. Daarenteen het die metaboliete van M. smegmatis mc2155 'n konsentrasie-afhanklike afname in sel lewensvatbaarheid getoon, waar hoër konsentrasies tot 'n laer lewensvatbaarheid gelei het. Merkwaardig genoeg het die 25 mg/mL konsentrasie sitotoksiese effekte op die selle getoon. Wanneer M. smegmatis mc2155--geïnfekteerde H9c2-selle met die eerstelyns antituberkulose middels behandel is, het rifampisien 'n verlaagde sel lewensvatbaarheid van 57% in vergelyking met die kontrole getoon, wat op die selle se vatbaarheid vir infeksie dui. Merkwaardig genoeg het geïnfekteerde selle deurgaans 'n laer lewensvatbaarheid getoon oor alle medicament behandelings in vergelyking met hul ongeïnfekteerde eweknieë. Verder het die studie aangetoon dat behandeling met rifampisien en M. smegmatis mc2155- sekondêre metaboliete tot 'n toename in vroeë apoptotiese selle gelei het. Dit dui op 'n effektiewe aktivering van apoptose-roetes in vergelyking met die onbehandelde kontrole (0.08%). Daarbenewens het DMSO (10%) 'n statisties beduidende afname in die aantal lewensvatbare selle getoon (29.07%) in vergelyking met die onbehandelde kontrole (99.58%), Stellenbosch University https://scholar.sun.ac.za v tesame met 'n toename in nekrose (70.93%), in teenstelling met die 0.14% wat in die onbehandelde kontrole waargeneem is. Variasie in basale respiratoriese tempo was waargeneem onder die behandelings groepe in vergelyking met die onbehandelde kontrole. Lek repirasie, wat verband hou met protone-lek oor die binne mitochondriale membraan, het toegeneem wanneer selle met rifampisien en M. smegmatis mc2155 sekondêre metaboliete behandel is, wat dui op 'n ontwrigting in mitochondriale funksie en die binne mitochondriale membraan. OXPHOS CI+CII aktiwiteit, wat beide Komplekse I en II behels, het 'n beduidende afname in suurstofverbruik van die selle in al die behandelingsgroepe in vergelyking met die onbehandelde kontrole getoon. Hierdie afname dui op 'n potensiële ontwrigting in hierdie spesifieke segment van die elektrone transport ketting. Ten slotte beklemtoon hierdie studie die belang van die begrip van die impak van eerstelyns antituberkulose middels op hart selle, met inagneming van die potensiaal vir deur middel van medikasie veroorsaakte kardiotoksisiteit. Die resultate dui daarop dat H9c2 kardiomioblaste vatbaar is vir infeksie met M. smegmatis mc2155. Daarbenewens het M. smegmatis mc2155- sekondêre metaboliete 'n beduidende effek op die metaboliese aktiwiteit, die induksie van vroeë apoptose, en die ontwrigting van elektronvloei in die elektrone transport tketting. Hierdie bevindinge vereis verdere ondersoeke, veral met betrekking tot die effekte van eerstelyns middels in 'n 3D- of dieremodel.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Tuberkulose (TB) bly 'n beduidende globale gesondheids uitdaging wat 'n voortdurende evaluering van die doeltreffendheid en veiligheid van sy terapeutiese middels vereis. Hierdie studie het gefokus op die evaluering van die potensiële kardiotoksisiteit van vier antituberkulosemiddels, naamlik isoniasied, etambutol, pirasienamied, en rifampisien, op H9c2-rat ventrikulêre kardiomioblaste. Kardiotoksisiteit is 'n kritieke kommer, aangesien hierdie middels oor 'n lang tydperk toegedien word. Hierdie vooruitsigte in vitro studie het drie belangrike fases ingesluit. In die eerste fase het die studie die metaboliese aktiwiteit van eerstelyns antituberkulose middels, sekondêre metaboliete van Mycobacterium smegmatis mc2155, en M. smegmatis mc2155-geïnfekteerde H9c2-selle geëvalueer deur middel van MTT-toetse. Die tweede fase het ten doel gehad om die omvang en wyse van selsterfte wat deur hierdie stowwe veroorsaak word, deur middel van vloeisitometrie te bepaal. Laastens het die derde fase ‘n evaluering van mitochondriale oksidatiewe fosforilasie (OXPHOS) met behulp van die Oroboros Oxygraph-2K ingesluit. Die eerstelyns antituberkulose middels het geen sitotoksiese effek op die selle getoon nie. Daarenteen het die metaboliete van M. smegmatis mc2155 'n konsentrasie-afhanklike afname in sel lewensvatbaarheid getoon, waar hoër konsentrasies tot 'n laer lewensvatbaarheid gelei het. Merkwaardig genoeg het die 25 mg/mL konsentrasie sitotoksiese effekte op die selle getoon. Wanneer M. smegmatis mc2155--geïnfekteerde H9c2-selle met die eerstelyns antituberkulose middels behandel is, het rifampisien 'n verlaagde sel lewensvatbaarheid van 57% in vergelyking met die kontrole getoon, wat op die selle se vatbaarheid vir infeksie dui. Merkwaardig genoeg het geïnfekteerde selle deurgaans 'n laer lewensvatbaarheid getoon oor alle medicament behandelings in vergelyking met hul ongeïnfekteerde eweknieë. Verder het die studie aangetoon dat behandeling met rifampisien en M. smegmatis mc2155- sekondêre metaboliete tot 'n toename in vroeë apoptotiese selle gelei het. Dit dui op 'n effektiewe aktivering van apoptose-roetes in vergelyking met die onbehandelde kontrole (0.08%). Daarbenewens het DMSO (10%) 'n statisties beduidende afname in die aantal lewensvatbare selle getoon (29.07%) in vergelyking met die onbehandelde kontrole (99.58%), Stellenbosch University https://scholar.sun.ac.za v tesame met 'n toename in nekrose (70.93%), in teenstelling met die 0.14% wat in die onbehandelde kontrole waargeneem is. Variasie in basale respiratoriese tempo was waargeneem onder die behandelings groepe in vergelyking met die onbehandelde kontrole. Lek repirasie, wat verband hou met protone-lek oor die binne mitochondriale membraan, het toegeneem wanneer selle met rifampisien en M. smegmatis mc2155 sekondêre metaboliete behandel is, wat dui op 'n ontwrigting in mitochondriale funksie en die binne mitochondriale membraan. OXPHOS CI+CII aktiwiteit, wat beide Komplekse I en II behels, het 'n beduidende afname in suurstofverbruik van die selle in al die behandelingsgroepe in vergelyking met die onbehandelde kontrole getoon. Hierdie afname dui op 'n potensiële ontwrigting in hierdie spesifieke segment van die elektrone transport ketting. Ten slotte beklemtoon hierdie studie die belang van die begrip van die impak van eerstelyns antituberkulose middels op hart selle, met inagneming van die potensiaal vir deur middel van medikasie veroorsaakte kardiotoksisiteit. Die resultate dui daarop dat H9c2 kardiomioblaste vatbaar is vir infeksie met M. smegmatis mc2155. Daarbenewens het M. smegmatis mc2155- sekondêre metaboliete 'n beduidende effek op die metaboliese aktiwiteit, die induksie van vroeë apoptose, en die ontwrigting van elektronvloei in die elektrone transport tketting. Hierdie bevindinge vereis verdere ondersoeke, veral met betrekking tot die effekte van eerstelyns middels in 'n 3D- of dieremodel.
Description
Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2023.