Quantifying the insulin response in mouse C2C12 skeletal muscle: a minimal modelling approach
Date
2021-12
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: The insulin signalling cascade is one of the most important regulatory and signalling
pathways in humans. Dysregulation or dysfunction of the insulin signalling path-
ways often underlies the molecular ætiology of diseases such as diabetes, obesity, and
Alzheimer’s. In turn, these diseases are the harbingers of various co-morbidities such
as cardio-vascular disease, chronic inflammation, and dementia. The healthcare, eco-
nomic, personal, and mortality burden of these diseases cannot be overstated.
Mathematical modelling of insulin signalling is indispensable in the effort to un-
derstand the dynamics of the insulin signalling cascade and how malfunctions therein
lead to disease. However, despite the availability and complexity of existing models,
few have explicitly connected the signalling cascade, glucose transporter activity, and
metabolism with one another. In order to study these interactions, a ‘three-module’
approach was adopted that defined the signalling cascade, glucose transporter activ-
ity, and metabolism as core, ‘input-output’ modules. The present work is limited to
the signalling cascade and glucose transporter activity modules whereas work by Dr.
Cobus van Dyk is concerned with the metabolic module.
With this in mind, this thesis sets forth three aims. Firstly, to establish standard-
ised culturing conditions which can be used to determine the basal state of insulin
signalling and glucose transporter activity. Secondly, to develop a core, mathemati-
cal model based on Western blotting and radio-labelled glucose -assay data which is
able to describe the concentration- and time-dependence of the signalling cascade and
glucose transporter activity in response to insulin. Thirdly, to determine the clustering
behaviour of GFP-tagged GLUT4 molecules in response to insulin.
The first goal was to standardise culturing conditions. Herein, the ability of high
(25mM), medium (15mM), and low (5mM) glucose culturing conditions were evalu-
ated with regards to their ability to sensitise or desensitise the insulin signalling cascade
as well as the degree to which they are able to induce the differentiation of C2C12 my-
oblasts into myocytes. The glucose and lactate concentrations in the external media
were used to determine the glucose-lactate flux of the C2C12 cells. This served as
a proxy for the induction of insulin-dependent glucose transport and metabolism. A
modified Ladd staining protocol was used to assess the degree to which C2C12 cells
could differentiate under the culturing protocols.
The second goal was to construct a core, mathematical model of insulin signalling
and glucose transporter activity. The time-dependent phosphorylation and dephos-
phorylation of the insulin receptor and the serine 473 and threonine 308 sites of Akt
in response to varying insulin concentrations was investigated using Western blotting
techniques. The glucose transporter (GLUT4) activity was assayed using radio-carbon
glucose. The data were used to optimise parameters for a core, ODE-based model of
the signalling and glucose transporter modules.
The third goal, to investigate the clustering behaviour of GLUT4 in response to
insulin, was investigated by using confocal microscopy to image GFP-tagged GLUT4
molecules before and after being stimulated with insulin. A hierarchical clustering
algorithm as well as further geometric and statistical analyses were used to determine
the number, size, density, and distribution of GLUT4 clusters pre and post insulin
exposure.
Of the remaining chapters, Chapter 1 discusses the background, context, scope,
and aims of this study as well as further elaborating on the ‘three module’ approach.
The literature review in Chapter 2 provides an overview of the relevant literature as
delineated by the scope and aims of this study. The materials and methods are provided
in Chapter 3, with specific alterations or methodologies being further discussed in the
relevant experimental chapters. The final chapter, Chapter 7, provides the reader with
general discussions, limitations, and final thoughts concerning this work.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Die insulien seinkaskade is een van die belangrikste regulerings- en sein padweë in mense. Disregulering of disfunksie van die insulien sinweë is dikwels onderliggend aan die molekulêre etiologie van siektes soos diabetes, vetsug en Alzheimers. Verder is hierdie siektes die draers van verskillende ko-morbiditeite soos hartvatsiektes, chroniese ontsteking, demensie en ander. Die gesondheids, ekonomiese, persoonlike en sterftes- las van hierdie siektes kan nie oorskat word nie. Wiskundige modellering van insulien seinweë is onontbeerlik in die poging om die dinamika van die insulien seinkaskade te verstaan en hoe wanfunksies daarin tot siektes lei. Ondanks die beskikbaarheid en ingewikkeldheid van die bestaande mod- elle, het min die seinkaskade, glukose-vervoerderaktiwiteit en metabolisme egter ek- splisiet met mekaar verbind. Ten einde hierdie interaksies te bestudeer, is ‘n ‘drie- module’-benadering aangewend wat die seinkaskade, glukose-vervoerderaktiwiteit en metabolisme as kernmodules as ‘n ’inset-uitset’ model gedefinieer het. Die huidige werk is beperk tot die seinkaskade en glukose-vervoerdersaktiwiteitsmodules, terwyl werk deur dr. Cobus van Dyk gemoeid is met die metaboliese module. Met die oog hierop stel hierdie proefskrif drie doelstellings. Eerstens, om ges- tandaardiseerde kweektoestande vas te stel wat gebruik kan word om die basale toe- stand van insulien seine en glukose-vervoerderaktiwiteit te bepaal. Tweedens, om ‘nkern, wiskundige model te ontwikkel gebaseer op Westerse klad-tegnieke en radio- toetsdata, wat die konsentrasie en tydafhanklikheid van die seinkaskade en glukosever- voerder kan beskryf as ‘n gevolg van insulien blootstelling. Derdens, om die groeper- ingsgedrag van GFP-gemerkte GLUT4-molekules in reaksie op insulien te bepaal. Die eerste doelwit, met betrekking tot gestandaardiseerde kweektoestande, word aangebied in hoofstuk 4. Hierin is die vermoë van hoë (25mM), medium (15mM) en lae (5mM) kweektoestande geëvalueer met betrekking tot hul kapasiteit om die insulien seinkaskade te sensitiseer of te desensitiseer, asook die mate waarin hulle die differensiasie van C2C12-myoblaste in miosiete kan veroorsaak. Die skynbare glukose-laktaatvloei in die eksterne media dien as ‘n gevolmagtigde maatstaf vir die induksie van insulienafhanklike glukosevervoer en metabolisme. ‘n Gemodifiseerde LADD-kleuringprotokol is gebruik om die mate waarin C2C12-selle kan onderskei te bepaal. Die tweede doelwit, om ‘n kern, wiskundige model van insulien seinweë en die glukosevervoerder aktiwiteit te konstrueer, word in hoofstuk 5 nagestreef. Die fos- forilering en ontfosforylering van die insulienreseptor en die serien 473 en treonien 308-posisies van die intermediêre seinmolekule (Akt) in reaksie op wisselende in- sulienkonsentrasies, sowel as tyd, is met behulp van Westerse klad-tegnieke onder- soek. Die glukose-vervoerder (GLUT4) -aktiwiteit is met behulp van radio-koolstof glukose ondersoek. Die data is gebruik om parameters te optimaliseer vir ‘n kern- GDV-gebaseerde model van die sein en glukose-vervoermodules. Die derde doelwit, wat die groeperingsgedrag van GLUT4 in reaksie op insulien ondersoek het, word in hoofstuk 6 aangebied. Konfokale mikroskopie is gebruik om GFP-gemerkte GLUT4-molekules wat sonder en met insulien gestimuleer is te analiseer. ‘n Hiërargiese groeperingsalgoritme sowel as verdere meetkundige en statistiese ontledings is gebruik om die aantal, grootte, digtheid en verspreiding van GLUT4- groepe voor en na insulienblootstelling te bepaal. Van die hoofstukke wat nog nie hier bespreek is nie, bied hoofstuk 1 die agter- grond, konteks, omvang en doelstellings van hierdie studie, asook die uitwerking van die ‘drie module’-benadering. Terwyl die literatuuroorsig in hoofstuk 2 bied ‘n onder- soek van die relevante literatuur soos uiteengesit in die omvang en doelstellings van hierdie studie. Die materiaale en metodes word in hoofstuk 3 verskaf, met spesifieke wysigings of metodologieë wat in die betrokke eksperimentele hoofstukke verder be- spreek word. Die finale hoofstuk, hoofstuk 7, sal die leser voorsien met algemene besprekings, beperkings en afsluitende gedagtes rakende hierdie werk.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Die insulien seinkaskade is een van die belangrikste regulerings- en sein padweë in mense. Disregulering of disfunksie van die insulien sinweë is dikwels onderliggend aan die molekulêre etiologie van siektes soos diabetes, vetsug en Alzheimers. Verder is hierdie siektes die draers van verskillende ko-morbiditeite soos hartvatsiektes, chroniese ontsteking, demensie en ander. Die gesondheids, ekonomiese, persoonlike en sterftes- las van hierdie siektes kan nie oorskat word nie. Wiskundige modellering van insulien seinweë is onontbeerlik in die poging om die dinamika van die insulien seinkaskade te verstaan en hoe wanfunksies daarin tot siektes lei. Ondanks die beskikbaarheid en ingewikkeldheid van die bestaande mod- elle, het min die seinkaskade, glukose-vervoerderaktiwiteit en metabolisme egter ek- splisiet met mekaar verbind. Ten einde hierdie interaksies te bestudeer, is ‘n ‘drie- module’-benadering aangewend wat die seinkaskade, glukose-vervoerderaktiwiteit en metabolisme as kernmodules as ‘n ’inset-uitset’ model gedefinieer het. Die huidige werk is beperk tot die seinkaskade en glukose-vervoerdersaktiwiteitsmodules, terwyl werk deur dr. Cobus van Dyk gemoeid is met die metaboliese module. Met die oog hierop stel hierdie proefskrif drie doelstellings. Eerstens, om ges- tandaardiseerde kweektoestande vas te stel wat gebruik kan word om die basale toe- stand van insulien seine en glukose-vervoerderaktiwiteit te bepaal. Tweedens, om ‘nkern, wiskundige model te ontwikkel gebaseer op Westerse klad-tegnieke en radio- toetsdata, wat die konsentrasie en tydafhanklikheid van die seinkaskade en glukosever- voerder kan beskryf as ‘n gevolg van insulien blootstelling. Derdens, om die groeper- ingsgedrag van GFP-gemerkte GLUT4-molekules in reaksie op insulien te bepaal. Die eerste doelwit, met betrekking tot gestandaardiseerde kweektoestande, word aangebied in hoofstuk 4. Hierin is die vermoë van hoë (25mM), medium (15mM) en lae (5mM) kweektoestande geëvalueer met betrekking tot hul kapasiteit om die insulien seinkaskade te sensitiseer of te desensitiseer, asook die mate waarin hulle die differensiasie van C2C12-myoblaste in miosiete kan veroorsaak. Die skynbare glukose-laktaatvloei in die eksterne media dien as ‘n gevolmagtigde maatstaf vir die induksie van insulienafhanklike glukosevervoer en metabolisme. ‘n Gemodifiseerde LADD-kleuringprotokol is gebruik om die mate waarin C2C12-selle kan onderskei te bepaal. Die tweede doelwit, om ‘n kern, wiskundige model van insulien seinweë en die glukosevervoerder aktiwiteit te konstrueer, word in hoofstuk 5 nagestreef. Die fos- forilering en ontfosforylering van die insulienreseptor en die serien 473 en treonien 308-posisies van die intermediêre seinmolekule (Akt) in reaksie op wisselende in- sulienkonsentrasies, sowel as tyd, is met behulp van Westerse klad-tegnieke onder- soek. Die glukose-vervoerder (GLUT4) -aktiwiteit is met behulp van radio-koolstof glukose ondersoek. Die data is gebruik om parameters te optimaliseer vir ‘n kern- GDV-gebaseerde model van die sein en glukose-vervoermodules. Die derde doelwit, wat die groeperingsgedrag van GLUT4 in reaksie op insulien ondersoek het, word in hoofstuk 6 aangebied. Konfokale mikroskopie is gebruik om GFP-gemerkte GLUT4-molekules wat sonder en met insulien gestimuleer is te analiseer. ‘n Hiërargiese groeperingsalgoritme sowel as verdere meetkundige en statistiese ontledings is gebruik om die aantal, grootte, digtheid en verspreiding van GLUT4- groepe voor en na insulienblootstelling te bepaal. Van die hoofstukke wat nog nie hier bespreek is nie, bied hoofstuk 1 die agter- grond, konteks, omvang en doelstellings van hierdie studie, asook die uitwerking van die ‘drie module’-benadering. Terwyl die literatuuroorsig in hoofstuk 2 bied ‘n onder- soek van die relevante literatuur soos uiteengesit in die omvang en doelstellings van hierdie studie. Die materiaale en metodes word in hoofstuk 3 verskaf, met spesifieke wysigings of metodologieë wat in die betrokke eksperimentele hoofstukke verder be- spreek word. Die finale hoofstuk, hoofstuk 7, sal die leser voorsien met algemene besprekings, beperkings en afsluitende gedagtes rakende hierdie werk.
Description
Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2021.
Keywords
Insulin signalling, Mouse skeletal muscle cells, Insulin -- Mathematical models, Insulin -- Receptors, Mouse skeletal muscle cells, Glucose -- Mathematical models, UCTD