Small extracellular vesicle dynamics and microRNA cargo in response to gradient specific high intensity running
Date
2021-12
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Skeletal muscle adaptation in response to exercise is a highly dynamic process and small extracellular
vesicles (EVs) (30-150 nm) are postulated to be mediators of intercellular communication during this
process. Skeletal muscle comprises approximately 70% of total body mass and is thus likely a large
source of small EVs in circulation. The micro ribonucleic acid (miRNA) cargo of circulating small EVs
has been shown to adapt to differing physiological and pathological states. Therefore, the cargo of
these nanoparticles may serve as biomarkers of skeletal muscle adaptation to exercise. The aim of this
thesis was therefore, to determine the use of plasma, and small EV associated miRNAs as potential
biomarkers of skeletal muscle adaptation in healthy humans in response to gradient specific high
intensity running sessions.
Sixteen healthy young males completed a gradient specific high intensity running session (Uphill, +5%,
n=5) (downhill, -10%, n=5), or (level surface 0%, n=6). Unfasted blood samples were collected at
baseline, and a further blood sample was collected at 6 hr post-exercise. Small EVs were isolated from
plasma by size exclusion chromatography (SEC), using a 70 nm pore-size column. Multiple analyses
were conducted on the isolated SEC fractions, including nanoparticle tracking analysis (NTA), scanning
transmission electron microscopy (STEM), enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for
lipoprotein markers, as well as western blot (WB) for exosomal markers. Based on results from these
methods, fractions 7-9 were pooled for small EV miRNA analysis. Five myomiRs and three skeletal
muscle important miRNAs were analysed using quantitative polymerase chain reaction (qPCR) in both
plasma and small EVs.
Nanoparticle numbers peaked in fraction 11 with no change in small EV size or number at 6 hr post-
exercise. Particles corresponding to the diameter of small EVs were abundant in pooled fractions 7-9
with less visible contamination than the later pooled fractions 8-10 (as shown by STEM). This was
confirmed to be lipoprotein contamination (ELISA). Western blot analysis confirmed the presence of the
exosomal marker TSG101 and skeletal muscle specific-exosome marker α-sarcoglycan in the small EV
enriched fractions. In small EVs, the uphill and downhill groups had distinct patterns of relative
abundance of miR-206, increasing in the downhill group and decreasing in the uphill group at the 6 hr
timepoint. In Plasma, the relative abundance of miR-206 was increased 6 hr post-exercise in the
downhill group only. In contrast, there was a decrease in relative abundance of miR-23a due to exercise,
regardless of gradient.
In conclusion, this thesis showed that three gradient specific high intensity running sessions caused
significant alterations in the relative abundance of miRNAs in plasma and in small EVs. These
responses, and specifically small EV miR-206 were distinctly different between the gradient specific
groups. Also, the abundance of miR-206 was different between the two miRNA pools. Therefore, miR-
206 may be able to serve as a biomarker for the initiation of skeletal muscle adaptation following muscle
damaging exercise and to distinguish if exercise was damaging or not.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Skeletspieraanpassing as gevolg van oefening is hoogs dinamies en dit word beweer dat ekstrasellulêre vesikels (klein EVs van 30-150 nm) as tussengangers van intersellulêre kommunikasie daartydens mag dien. Skeletspiere beslaan ongeveer 70% van liggaamsmassa en is dus waarskynlik 'n groot bron van klein EV's in omloop. Sirkulerende klein EVs bevat mikroribonukleïensuur (miRNA) wat aanpas met verskillende fisiologiese and patofisiologiese toestande. Derhalwe, kan die inhoud van hierdie nanopartikels dalk gebruik word as biomerkers van oefeningsaanpassings. Die doelstelling was om te bepaal of miRNAs in plasma of EVs as moontlike biomerkers van spieraanpassing in gesonde mense gebruik kan word in reaksie op hoë intensiteit oefening, spesifiek hardloop teen verskillende hellings. Sestien gesonde jong mans het ‘n helling-spesifieke hoë intensiteit oefensessie voltooi (opdraand, +5%, n=5) (afdraand, -10%, n=5), of (gelyke vlak 0%, n=6). Nie-vastende bloedmonsters is geneem alvorens met die oefensessie begin is, asook 6 uur na oefening. Klein EVs is vanuit plasma geïsoleer deur middel van grootte-uitsluitingskromatografie (SEC) in ‘n kolom met 70 nm porie-grootte. Daarna is verskeie analiese gedoen op geïsoleerde gedeeltes, geskei volgens grootte. Analiese het ingesluit, wat nanopartiekel naspeur-analiese (NTA), skanderende deurlatende elektronmikroskopie (STEM), ensiem-gebonde immuunsorberende analiese (ELISA) vir lipoproteïen merkers, sowel as Westerse klad (WB) vir eksosoom merkers. Gebaseer op die resultate, is gedeeltes 7-9 saamgevoeg vir EV miRNA analiese. Vyf miomiRs en drie miRNAs van belang tot spier, is geanaliseer deur gebruik te maak van kwantitatiewe polimerase kettingreaksie (qPCR) in beide plasma and klein EVs. Nanopartiekelgetalle het die hoogtepunt bereik in gedeelte 11 met geen veranderinge in EV grootte of hoeveelheid 6 ure na oefening nie. Partiekels met ‘n deursnit ooreenstemmend met die van klein EVs was volop in gedeeltes 7-9 met min kontaminasie in vergelyking met die kontaminasie in die saamgevoegde gedeeltes 8-10 (soos ook gesien met STEM). Deur middel van ELISA is dit bevestig dat die kontaminasie lipoproteïene bevat. WB-analiese het die teenwoordigheid van die eksosoom merker TSG101, asook die skeletspier-spesifieke merker α-sarkoglikaan, in die klein EV verrykde gedeeltes bevestig. In klein EVs, is groot hoeveelhede miR-206 in opdraand en afdraand groepe waargeneem, met ‘n toename in die afdraand groep and afname in die opdraende groep teen die 6-uur tydspunt na oefening. In plasma monsters is die miR-206 relatief volop, maar het slegs in die afdraand groep toegeneem teen die 6-uur tydspunt. In teenstelling hiermee, was daar ‘n vermindering in die relatiewe hoeveelheid miR-23a in reaksie op oefening, ongeag die helling. Ter afsluiting, hierdie tesis het getoon dat drie hellingspesifieke hoë intensiteit oefeningsessies beduidende veranderinge in die relatiewe hoeveelheid miRNAs in plasma and klein EVs veroorsaak het. Hierdie veranderinge, veral die van klein EV miR-206, was beduidend verskillend tussen die hellingspesifieke oefeningsgroepe. Daarbenewens, het die hoeveelheid miR-206 in die twee poele waarvan die miRNA afkomstig was, verskil. Derhalwe, mag miR-206 dalk kan dien as ‘n biomerker vir die aanvang van spierveranderinge as gevolg van hoë intensiteit oefening, met ‘n aanduiding of die oefening spierskade veroorsaak het of nie.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Skeletspieraanpassing as gevolg van oefening is hoogs dinamies en dit word beweer dat ekstrasellulêre vesikels (klein EVs van 30-150 nm) as tussengangers van intersellulêre kommunikasie daartydens mag dien. Skeletspiere beslaan ongeveer 70% van liggaamsmassa en is dus waarskynlik 'n groot bron van klein EV's in omloop. Sirkulerende klein EVs bevat mikroribonukleïensuur (miRNA) wat aanpas met verskillende fisiologiese and patofisiologiese toestande. Derhalwe, kan die inhoud van hierdie nanopartikels dalk gebruik word as biomerkers van oefeningsaanpassings. Die doelstelling was om te bepaal of miRNAs in plasma of EVs as moontlike biomerkers van spieraanpassing in gesonde mense gebruik kan word in reaksie op hoë intensiteit oefening, spesifiek hardloop teen verskillende hellings. Sestien gesonde jong mans het ‘n helling-spesifieke hoë intensiteit oefensessie voltooi (opdraand, +5%, n=5) (afdraand, -10%, n=5), of (gelyke vlak 0%, n=6). Nie-vastende bloedmonsters is geneem alvorens met die oefensessie begin is, asook 6 uur na oefening. Klein EVs is vanuit plasma geïsoleer deur middel van grootte-uitsluitingskromatografie (SEC) in ‘n kolom met 70 nm porie-grootte. Daarna is verskeie analiese gedoen op geïsoleerde gedeeltes, geskei volgens grootte. Analiese het ingesluit, wat nanopartiekel naspeur-analiese (NTA), skanderende deurlatende elektronmikroskopie (STEM), ensiem-gebonde immuunsorberende analiese (ELISA) vir lipoproteïen merkers, sowel as Westerse klad (WB) vir eksosoom merkers. Gebaseer op die resultate, is gedeeltes 7-9 saamgevoeg vir EV miRNA analiese. Vyf miomiRs en drie miRNAs van belang tot spier, is geanaliseer deur gebruik te maak van kwantitatiewe polimerase kettingreaksie (qPCR) in beide plasma and klein EVs. Nanopartiekelgetalle het die hoogtepunt bereik in gedeelte 11 met geen veranderinge in EV grootte of hoeveelheid 6 ure na oefening nie. Partiekels met ‘n deursnit ooreenstemmend met die van klein EVs was volop in gedeeltes 7-9 met min kontaminasie in vergelyking met die kontaminasie in die saamgevoegde gedeeltes 8-10 (soos ook gesien met STEM). Deur middel van ELISA is dit bevestig dat die kontaminasie lipoproteïene bevat. WB-analiese het die teenwoordigheid van die eksosoom merker TSG101, asook die skeletspier-spesifieke merker α-sarkoglikaan, in die klein EV verrykde gedeeltes bevestig. In klein EVs, is groot hoeveelhede miR-206 in opdraand en afdraand groepe waargeneem, met ‘n toename in die afdraand groep and afname in die opdraende groep teen die 6-uur tydspunt na oefening. In plasma monsters is die miR-206 relatief volop, maar het slegs in die afdraand groep toegeneem teen die 6-uur tydspunt. In teenstelling hiermee, was daar ‘n vermindering in die relatiewe hoeveelheid miR-23a in reaksie op oefening, ongeag die helling. Ter afsluiting, hierdie tesis het getoon dat drie hellingspesifieke hoë intensiteit oefeningsessies beduidende veranderinge in die relatiewe hoeveelheid miRNAs in plasma and klein EVs veroorsaak het. Hierdie veranderinge, veral die van klein EV miR-206, was beduidend verskillend tussen die hellingspesifieke oefeningsgroepe. Daarbenewens, het die hoeveelheid miR-206 in die twee poele waarvan die miRNA afkomstig was, verskil. Derhalwe, mag miR-206 dalk kan dien as ‘n biomerker vir die aanvang van spierveranderinge as gevolg van hoë intensiteit oefening, met ‘n aanduiding of die oefening spierskade veroorsaak het of nie.
Description
Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2021.
Keywords
Extracellular vesicles, MicroRNA, Exercise -- Physiological aspects, Skeletal muscle, UCTD